蛋白质与蛋白组学

请看《蛋白质技术手册》汪家政，范明编的

非还原：不能有DTT及beta-巯基乙醇等还原剂

可以有SDS
不加热

marshall80 wrote:
版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明 样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！

1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的

能加热变性

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我想问 非还原到底可以加热吗？？

如图，本想比较一下GAPDH内参好调整上样量，但一个出来了，另一个没出来。最上面是白蛋白67kDa。两种细胞都是rat来源。是不是剪膜时把内参剪掉了，但我感觉可能性不大。请问还有其他原因吗？

[ 本帖最后由 tuuu2 于 2013-4-3 10:51 编辑 ]

试过阳性样品吗？

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阳性样品是指高表达这个蛋白的样品吗？需要买还是自己提取的就行？

可以用GAPDH或者beta-tubulin呢

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谢谢老师！还有一个问题：
我们每次在做wb前都要配制样品，我们的样品中除了要加5*上缓外，还要加水和DTT，我不知道DTT的作用是什么？它会对我们做的蛋白有影响吗？DTT和5*上缓的比例是1:2。

用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

用 的是自己配置的ECL发光液，用胶片曝光，也能爆出来条带，就连β-actin都很细，或者就是出不全，用的是abcam的抗体，1:5000的二抗，今天试了个1:2000，出来的条带还是一样的。

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这个胶跑的有问题哦
有考染的图片吗？

楼主你好，最近才开始ECL显色，我做的是p-ERK和p-p65，一抗是1:1000，二抗是1:5000，加入发光液后只有marker的位置有荧光，其他位置都没有，延长压片时间也没有条带，做actin有条带，条带的荧光很清晰，已经遇到两次这种问题了，回忆操作过程也找不出原因是什么，很上火

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p-erk是很好做的
p-p65，目前我没碰到好用的抗体

marker位置有荧光是正常的
1、有些marker本身就是可以发光的
2、有些marker中的蛋白与抗体有反应

一抗用的是哪里的？

老师你好，我想问一下左边的三张图发这样是压片时间过长还是抗体浓度过高？？

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稀释一抗、二抗

求助：主要问题是为什么泳道里没有条带，其余的部位这么黑！条件如下：电泳：100v，1.5小时转膜：300mA, 1小时封闭：5%脱脂奶粉 1小时一抗：1:500 封闭过夜4度二抗：1:2k， 室温40分钟ecl曝光后就这样了， 求高人指点！我怀疑：是否是我的蛋白没有转上，转过膜之后，槽里的电泳液都很热了， 膜和胶都很热了， 会有影响么？

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首先排除二抗浓度太高的问题
稀释二抗