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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-4-3 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参…… 那TGF-β1单抗，版主推荐的是哪家公司的？ 跟大鼠组织反应的。
哈哈还有个问题，就是细胞蛋白大概每孔需上多少的量？蛋白总量和体积？我用的是1mm的玻璃板，1mm的梳子，我上了30μg，用抗体孵育好，发现没测出来。想问下版主，细胞蛋白，怎么上最少的蛋白量测出我想要的结果？改用0.75mm的梳子？？上多少μg或μl？？ 同样条件下，组织50μg能做出来。

======================

细胞我们一般上样量10-20ug
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发表于 2013-4-3 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参…… 那TGF-β1单抗，版主推荐的是哪家公司的？ 跟大鼠组织反应的。
哈哈还有个问题，就是细胞蛋白大概每孔需上多少的量？蛋白总量和体积？我用的是1mm的玻璃板，1mm的梳子，我上了30μg，用抗体孵育好，发现没测出来。想问下版主，细胞蛋白，怎么上最少的蛋白量测出我想要的结果？改用0.75mm的梳子？？上多少μg或μl？？ 同样条件下，组织50μg能做出来。

=====================

如果细胞中做不出来
可能细胞中没有表达吧
我用的是CST公司的
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发表于 2013-4-3 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，想请教您两个问题
1. 提细胞总蛋白时培养基未洗干净就加了裂解液，会对蛋白提取造成什么影响吗？（这次细胞状态不太好，漂了不少，没敢使劲洗）
2. 二抗用久了为什么会出絮状沉淀？师兄说是反复4°C室温的结果，老师怎么看。这样的二抗还能用吗？

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1、会对蛋白定量产生很大的影响
2、二抗保存温度应该是多少？
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发表于 2013-4-3 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师能不能回答我 非还原-变性的蛋白如何处理？不加DTT 需要加热吗？DTT的终浓度是100mM还是50mM？

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非还原-变性
不加DTT或者beta-巯基乙醇
但是要加热变性
终浓度50mM或者62.5mM
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发表于 2013-4-3 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如图，本想比较一下GAPDH内参好调整上样量，但一个出来了，另一个没出来。最上面是白蛋白67kDa。两种细胞都是rat来源。是不是剪膜时把内参剪掉了，但我感觉可能性不大。请问还有其他原因吗？

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这个应该不是检测技术的问题
剪掉的可能性大
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发表于 2013-4-3 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，
我要做的是大鼠海马组织的WB，测定的是磷酸化Tau蛋白，请问老师我的内参，maker应该怎么选择呢？
谢谢！

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一般按照分子量来选择marker
看看fermentas有没有适合的marker
内参可以选择beta-actin、GAPDH、beta-tubulin，三种常用的
还可以参考文献，选择适合你这个模型的内参
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发表于 2013-4-3 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
阳性样品是指高表达这个蛋白的样品吗？需要买还是自己提取的就行？

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一般指在某一细胞或者组织中特异性高表达的样品

也特制：转染后过表达的，或者重组表达的样品
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发表于 2013-4-3 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我最近做Western的时候碰到了一个奇怪的问题，去暗房曝片子的时候发现我的目的条带要不就是前三个泳道特别浅，要不就是后三个泳道特别浅（一共6个泳道），但actin是正常的，而且丽春红染色后条带也是正常的，actin的膜和目的条带的膜都是同步操作的，只是用的一抗二抗不一样，能解决下我的疑惑吗？谢谢啦

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1、一抗是否回收使用了？
2、目的一抗孵育体系多大？如果太小，加大一倍
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 小中大
谢谢老师！还有一个问题：
我们每次在做wb前都要配制样品，我们的样品中除了要加5*上缓外，还要加水和DTT，我不知道DTT的作用是什么？它会对我们做的蛋白有影响吗？DTT和5*上缓的比例是1:2。

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为什么要加水？？？
这个配方很奇怪哦
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发表于 2013-4-3 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般指在某一细胞或者组织中特异性高表达的样品

也特制：转染后过表达的，或者重组表达的样品

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哦，谢谢，那我还是买吧，请问老师您了解CDKL5这个蛋白的抗体吗？我做的抗大鼠的，但是查来查去就santa一家有，但是抗体效价很低，1:200，好多人反应说santa的抗体容易出问题，后来我在文献上看到有用abcam抗大鼠的多抗，但是我在官网上没查到，想问一下，有可能是停产了吗？不好意思，可能我的问题有点超出您的范围了，但是实在是不懂，呵呵，谢谢老师
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