【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

nn255[使用道具]
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5891

发表于 2013-4-3 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

tricine胶不好跑
我跑过，效果不怎么样
这种小分子量的蛋白，我也没有经验

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查一些资料，就是跑非还原的SDS-PAGE。

xueyouzhang[使用道具]
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5892

发表于 2013-4-3 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

５%脱脂奶粉封闭一小时,acting一抗,1:1000，４度过夜，１：５０００兔二抗１小时，每次洗膜都是ＴＢＳＴ１０min,3次，背景总是过高，求老师分析原因。

附件

2013-4-3 16:19

87557038.snap.jpg (26.48 KB)

yonger[使用道具]
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5893

发表于 2013-4-3 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先谢谢楼主
我想请问一下我自己采用试剂盒提取的细胞总蛋白保存调节是-20摄氏度但是反复冻融几次之后就会出现絮状沉淀然后上清里面的蛋白质浓度就很低了 SDS-PAGE之后基本不能够曝光出条带我用考马斯亮蓝染色发现膜上其实是有蛋白质的只是量很少很少我估计是与生成了絮状沉淀有关请问这个问题要怎么解决谢谢！

misswu61[使用道具]
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5894

发表于 2013-4-3 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼主想问您一下 20KD一下的小蛋白的转膜时间应该大约在多久？多少电压呢？

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5895

发表于 2013-4-3 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做HSP27蛋白的western blot实验，但是做了很多次都没有结果。内参能做出来，但是目的条带就是没做出来过。我用的是10%的分离胶，5%的浓缩胶。转膜：半干转15V 30min（27kd的蛋白转膜时间是多少？会不会转过的情况？）。封闭1.5h，一抗1:1000过夜，二抗1:10000 37度1.5h，最后目的条带没有。请教高手指点迷津！

fox_79[使用道具]
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5896

发表于 2013-4-3 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好！有没有遇到这样的情况，就是最后扫描出的条带上会有很多纵行黑色杂质（请看下图），本来跑出来的条带还不错的，结果全被这些脏东西毁了，我不清是哪里出问题了，帮我分析一下哪些环节可能出现这样的情况，最近跑的两次都是这样，以前都没有出现过这样的情况的。谢谢您！还有就是有的条带中间破开，又是什么原因呢？

附件

2013-4-3 16:22

10296996.jpg (17.03 KB)

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5897

发表于 2013-4-3 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的大致步骤描述一下，上样体积在10-17微升间，电泳：80V,120V；电转：恒流220mA，时间为分子量的2倍；封闭：5%奶粉，摇床1.5h；一抗（1:100；santa cruz多克隆抗体）4度孵育16小时；二抗（1:10000，荧光标记二抗）避光，摇床孵育1h;我怀疑是不是PAGE胶有问题，因为除开TEMED是现成的，其他的都是自己用粉剂配制的。另外Tris-hcl（PH8.8和 PH6.8）均未经高压灭菌保存，配好后直接放在室温（现在开着空调，23度）；所以我怀疑是不是被污染了；
我还想我问一下，这些配置PAGE胶的试剂能否都放4度保存；还有1*电转液和电泳液能否回收使用，有没有次数限制；
这些是我最近的疑问，问得有些多，谢谢啦！

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5898

发表于 2013-4-3 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好：我想请教一下，我第一次做western，目的蛋白320KD,想请教一下浓缩胶和分离胶的浓度，电泳时在浓缩胶和分离胶中的条件（恒压还是恒流，数值多少较合适），以及转膜的条件？

因为做实验时间不是很多了，望能尽快给予指导，先在此表示感谢！

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5899

发表于 2013-4-3 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

５%脱脂奶粉封闭一小时,acting一抗,1:1000，４度过夜，１：５０００兔二抗１小时，每次洗膜都是ＴＢＳＴ１０min,3次，背景总是过高，求老师分析原因。

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调整二抗至1:10000
孵育时间：30min
室温
洗膜：3min，5-6次

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发表于 2013-4-3 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先谢谢楼主
我想请问一下我自己采用试剂盒提取的细胞总蛋白保存调节是-20摄氏度但是反复冻融几次之后就会出现絮状沉淀然后上清里面的蛋白质浓度就很低了 SDS-PAGE之后基本不能够曝光出条带我用考马斯亮蓝染色发现膜上其实是有蛋白质的只是量很少很少我估计是与生成了絮状沉淀有关请问这个问题要怎么解决谢谢！

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这种现象正常的
不能在-20度保存提取的蛋白样品
需要用-80度冰箱或者液氮

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