【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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5901

发表于 2013-4-3 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼主想问您一下 20KD一下的小蛋白的转膜时间应该大约在多久？多少电压呢？

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湿转：300mA恒流，20-30min都可以

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5902

发表于 2013-4-3 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做HSP27蛋白的western blot实验，但是做了很多次都没有结果。内参能做出来，但是目的条带就是没做出来过。我用的是10%的分离胶，5%的浓缩胶。转膜：半干转15V 30min（27kd的蛋白转膜时间是多少？会不会转过的情况？）。封闭1.5h，一抗1:1000过夜，二抗1:10000 37度1.5h，最后目的条带没有。请教高手指点迷津！！！

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内参做出来了？

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5903

发表于 2013-4-3 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好！有没有遇到这样的情况，就是最后扫描出的条带上会有很多纵行黑色杂质（请看下图），本来跑出来的条带还不错的，结果全被这些脏东西毁了，我不清是哪里出问题了，帮我分析一下哪些环节可能出现这样的情况，最近跑的两次都是这样，以前都没有出现过这样的情况的。谢谢您！还有就是有的条带中间破开，又是什么原因呢？

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样品中有沉淀

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5904

发表于 2013-4-3 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的大致步骤描述一下，上样体积在10-17微升间，电泳：80V,120V；电转：恒流220mA，时间为分子量的2倍；封闭：5%奶粉，摇床1.5h；一抗（1:100；santa cruz多克隆抗体）4度孵育16小时；二抗（1:10000，荧光标记二抗）避光，摇床孵育1h;我怀疑是不是PAGE胶有问题，因为除开TEMED是现成的，其他的都是自己用粉剂配制的。另外Tris-hcl（PH8.8和 PH6.8）均未经高压灭菌保存，配好后直接放在室温（现在开着空调，23度）；所以我怀疑是不是被污染了；
我还想我问一下，这些配置PAGE胶的试剂能否都放4度保存；还有1*电转液和电泳液能否回收使用，有没有次数限制；
这些是我最近的疑问，问得有些多，谢谢啦！

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1、电转与电泳液我们都不回收
2、不用进行高压灭菌
胶好不好的话，跑完SDS-PAGE用考马斯亮蓝染色

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5905

发表于 2013-4-3 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好，我最近在做western-blot，样本是猪的肠道黏膜，现在有个220kDa大小的ZO-1蛋白一直没做出来，现将我的实验条件跟你说明一下，望楼主指点一下：
1、样品制备：裂解液配方50mM Tris-HCl 7.4，150mM NaCl，1% IGEPAL GA-360，0.5% Sodium dexycholate，0.5% SDS，10mM 焦磷酸钠，1% Triton-X 100，样品采集后于-80度保存，裂解时采用液氮研磨后以1：9比例加入裂解液（使用时加入PMSF和cocktail）于冰上裂解30min，期间进行旋涡振荡数次，12000r/min-4度离心，收集上清，分装保存于-80度冰箱，上样前调整蛋白浓度后，以1：4比例加入5X上样缓冲液95度-5min变性，上样量为20ug
2、电泳条件：8%分离胶-5%浓缩胶，80V-20min，120V-1h；转膜：冰上湿转200mA-2.5h，染胶后胶上已经看不到蛋白条带
3、封闭：3%BSA室温封闭1h
4、抗体：ZO-1（santa兔抗和羊抗）、zymed（兔抗），3%BSA稀释：1：1000、1：500，1：250（3种比例都尝试过），4度过夜；二抗（兔抗和羊抗）1：3000，3%BSA
图1
图1是三种抗体，不同裂解液裂解的样品：配为上述裂解液配方裂解，NP-40、中和弱为碧云天裂解液
zymed有淡淡的条带，但不在220kDa位置

附件

2013-4-3 16:48

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5906

发表于 2013-4-3 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图2
0
图2是采用zymed兔抗的结果，但条带依然不在220kDa位置
本人的疑问：
1、样品裂解问题：ZO-1属于外周膜蛋白，是不是样品裂解时间不够，还是裂解过了，ZO-1蛋白降解成亚基了，不是是没有裂解出来还是裂解过头了，
2，抗体问题：我这种裂解方法做其它蛋白都没问题，有100多kDa的也没问题，目前就这个蛋白很头大，以前我师妹做出来过一次（图3如下）

附件

2013-4-3 16:48

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5907

发表于 2013-4-3 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图3-santa兔抗

附件

2013-4-3 16:49

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5908

发表于 2013-4-3 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图4-zymed兔抗,样品是猪肠上皮细胞样，有进行超声（3s-10次-4度），而我也有作过一次超声裂解的，

附件

2013-4-3 16:49

29067782.snap.jpg (34.24 KB)

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5909

发表于 2013-4-3 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如图5

现在真搞不清是什么问题，我师妹细胞样能做出来，但以前我的细胞样也没做出来过，还烦请楼主帮忙分析一下原因，谢谢

附件

2013-4-3 16:50

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5910

发表于 2013-4-3 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正在做人白细胞Rho 激酶活性即利用Western 检测MYPT-1，做了好几次都没结果。
6%的胶（目的蛋白 130KD 内参β-actin 42KD）电泳90分钟，BIO-rad湿转 2小时 260ma ，一抗 1:300-500都试过（santa公司的推荐 1:100-1000）孵育过夜，摇床复温2h，二抗 1:5000-10000（推荐 1:5000-100000）孵育2h，ECL发光，除目的蛋白有些非特异性的发光外（很少），内参一片空白，请老师解惑。

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