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标题:【讨论帖】western blot问题解答

utt0989[使用道具]
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发表于 2013-4-3 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-4-3 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近在做肾组织MCP-1的western，分子量12kd，用15%的分离胶，santa的一抗，都做到1:100了，还是没有带，只有背景。有没有做过这个蛋白的同道给指点一下迷津，还有如果要换一抗的话，有没有哪家公司的一抗可以推荐一下？谢谢。

======= ...

请问Abcam这个抗体好不好做，能否提供一下具体的条件，如转膜，抗体浓度等，谢谢。
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发表于 2013-4-3 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、样品跑完电泳后用考马斯亮蓝染过胶吗？
2、转膜后，用丽春红染过膜吗？

============================================================================================================

跑完电泳染过，目的蛋白位置没有条带，内参附近有条带，但不是特别清晰的那种。转膜后没用过丽春红。是我蛋白提取的问题吗？
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发表于 2013-4-3 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑完电泳染过，目的蛋白位置没有条带，内参附近有条带，但不是特别清晰的那种。转膜后没用过丽春红。是我蛋白提取的问题吗？

====================

内参蛋白检测结果很好？
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-4-3 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

新手问个问题，要跑40kd左右的蛋白，用多少的胶比较好，我看15%和10%都可以的，但是师兄让我用10%的，不知道为什么啊
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发表于 2013-4-3 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
新手问个问题，要跑40kd左右的蛋白，用多少的胶比较好，我看15%和10%都可以的，但是师兄让我用10%的，不知道为什么啊

=============

最好用12%的
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发表于 2013-4-3 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这位老师辛苦了，最近小弟立春红染色出现问题，100v，1小时，染色出现不规则形状图形，已赶过气泡，上图，请老师帮忙看看是什么问题，怎么解决？


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发表于 2013-4-3 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问一下分子量两百多在wb时应该注意些?_?啊？
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发表于 2013-4-3 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
常规的western blot实验通过 每孔上样的目的蛋白含量不同，与同样的一抗孵育，通过条带的灰度值进行半定量

我做的western blot一抗来源于患者血清，上样时可以保证每孔抗原底物完全 相同，然后一抗孵育不同的抗体（患者血清）。我的设计思路是 根据 条带的灰度值 对 抗体（患者血清） 进行定量，不知道这样是否靠谱？

如果不靠谱的话，有没有什么方法进行改良？
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发表于 2013-4-3 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
請教個問題，我做出來的蛋白分子量在60kD 左右，可是，我的目標蛋白是pSTAT3，大概80kD左右。高手們，這是啥問題呢？蛋白被降解了么？以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝！
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NBA[使用道具]
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 小中大
这位老师辛苦了，最近小弟立春红染色出现问题，100v，1小时，染色出现不规则形状图形，已赶过气泡，上图，请老师帮忙看看是什么问题，怎么解决？

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跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染色看看效果
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