蛋白质与蛋白组学

请问一下分子量两百多在wb时应该注意些?_?啊？

==============

正常操作即可

常规的western blot实验通过 每孔上样的目的蛋白含量不同，与同样的一抗孵育，通过条带的灰度值进行半定量

我做的western blot一抗来源于患者血清，上样时可以保证每孔抗原底物完全 相同，然后一抗孵育不同的抗体（患者血清）。我的设计思路是 根据 条带的灰度值 对 抗体（患者血清） 进行定量，不知道这样是否靠谱？

如果不靠谱的话，有没有什么方法进行改良？

===================================

不是特别靠谱
考虑一下如何消除误差
因为每孔蛋白量相同，但是误差如何排除？
如果可以排除这个蛋白量的误差就可以
目前有一种方法是ELISA，理论上可以定量

請教個問題，我做出來的蛋白分子量在60kD 左右，可是，我的目標蛋白是pSTAT3，大概80kD左右。高手們，這是啥問題呢？蛋白被降解了么？以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝！

==============================================

1、没有加蛋白抑制剂及磷酸酶抑制剂？
2、用BSA封闭及孵育抗体
3、样品跑完电泳，SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染胶了吗？

跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染色看看效果

===============================================================================================================

老师你好，我今天做了一次，两块胶，一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，考马斯染色条带很好，但立春红染色依旧是花的，请问是不是说明问题出在转膜上？具体是什么问题，应该怎么改进？谢谢

真心佩服楼主无私奉献
另外请教
我的靶蛋白表达量很低，那么多低就不建议做WB了呢
感谢

================================

目前WB的敏感性可以到fg级别
基本上的蛋白都可以用WB来检测的

老师你好，我今天做了一次，两块胶，一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，考马斯染色条带很好，但立春红染色依旧是花的，请问是不是说明问题出在转膜上？具体是什么问题，应该怎么改进？谢谢

================================

1、什么膜？是否正确处理了？
2、湿转还是半干转？
3、转膜条件？
4、如果半干转的话，可能电极板坏了

请教一下，做的目的蛋白11kd，用的抗体是santa的。做了几次都是是白色的条带，很诧异，不知如何改进。

现提取的蛋白，裂解液中加了PMSF，每孔上样大概8-10ug；现配的胶上层5%、下层15%；电泳80V-120V；转膜稳流200mA、50分钟；现配的5%BSA in TBST封闭1小时；现配的一抗也在5%BSA in TBST中，浓度是1:600，室温半小时-过夜4℃孵育-室温1小时复温；一抗洗膜4次各10分钟；二抗已经是重复利用过一次的了，1:4000的抗兔二抗（直接in TBST），室温1小时；二抗洗膜10分钟1次、6分钟2次；然后就发光了。

坛子里有说二抗上的酶过度催化，会出白色条带，因此可能是抗原过多，或抗体浓度过高的问题，那究竟是一抗高了还是二抗过多？如何进行调整呢？
不胜感激！

============

内参图片呢？