【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

popo520[使用道具]
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5971

发表于 2013-4-3 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天刚刚做了个western blot，出现了一个很奇怪的现象，就是曝光后为什么马克泳道上面也出现了显影？请老师分析一下这种现象对吗？下面是图片

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2013-4-3 17:45

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popo520[使用道具]
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5972

发表于 2013-4-3 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

左手边上的那条就是马克条带，你看看出现这样的现象怎么解释？那地方有问题？谢谢您

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5973

发表于 2013-4-3 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好,老师,我想问一下,蛋白酶抑制剂加几种合适?是不是把配方里的抑制剂都加上,细胞裂解时蛋白降解的少?另外,我的目的蛋白内源性表达为9KD,是个核蛋白,过表达的蛋白为30-40KD大小,可是我坐了3次WBl,每次都是内参可以跑出条带,但是目的蛋白没有跳带?我想问一下,我应该如何改进实验,才能做出来,谢谢了,辛苦您了,

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5974

发表于 2013-4-3 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没有染色呢。。。因为之前师姐做从没染过色但是都曝的很好。。。

==========

请染色

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5975

发表于 2013-4-3 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天刚刚做了个western blot，出现了一个很奇怪的现象，就是曝光后为什么马克泳道上面也出现了显影？请老师分析一下这种现象对吗？下面是图片

========================

marker有条带是正常的
这个要从抗体制备开始考虑

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5976

发表于 2013-4-3 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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5977

发表于 2013-4-3 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请染色

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噢染色会影响后面抗体结合吗？还有我上午又做了一次还是没有
曝光后的膜没有扔还能染色吗?

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5978

发表于 2013-4-3 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好：我做肝组织的western blot实验，目的蛋白有包浆也有胞核蛋白，有几个问题请教。1：我的蛋白提取和普通组织提取是否一样就可以？我这两次测出的蛋白浓度都很高，最好应该在什么范围？上样量在多少比较好？2,：我用的碧云天普通的裂解液是否可以？核内蛋白能裂解出来吗？3：磷酸酶抑制剂用加吗？组织离心我用的是15000G，15MIN，可以吗？4：我做的蛋白是PKC和p38，老师能根据蛋白给点宝贵建议吗？做了好几次都没出来

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5979

发表于 2013-4-3 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主，我最近在做分子量是十几的蛋白，可是一直做不出来，一抗浓度是1：2000，二抗是1:2000。胶的浓度是15%，转膜条件是100mA, 60min。一抗是4度过夜，二抗是室温孵育1个小时。同样的膜上压出来的atin的效果很好。我想知道，做不出来的原因可能有哪些，有什么可以改善的地方。非常感谢

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发表于 2013-4-3 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教老师一个问题，我现在做Rat的肌肉组织，检测蛋白是GLUT4，用过santa和博士德的抗体，说明书上注明是50kd左右，但是现在曝光出来在43kd和34kd出现很明显的条带，压片很久才在55kd左右才会有条很弱的带，GLUT4应该是在肌肉组织里面是特异性的表达，其他人推荐我提取膜蛋白，因为GLUT4是在膜上表达，是不是蛋白在哪里表达就提取哪里的蛋白？
还有就是，我在同一张膜上面，上部分做80kd左右的蛋白，下部分做GLUT4，但是GLUT4曝光出来后出现竖条的背景，正常的条带应该是水平的一条，两个蛋白做的条件都是一样的，封闭是5%牛奶37°C 1h，一抗是4°C过夜，两者一抗来源是一样的，二抗是1：20000 室温1h。后来我将样本离心后再上样，还是出现竖条的背景，希望老师给点建议。谢谢

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