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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-4-3 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
噢 染色会影响后面抗体结合吗？还有 我上午又做了一次 还是没有
曝光后的 膜没有扔 还能染色吗?

============

不会有影响
可以染色
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发表于 2013-4-3 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好：我做肝组织的western blot实验，目的蛋白有包浆也有胞核蛋白，有几个问题请教。1：我的蛋白提取和普通组织提取是否一样就可以？我这两次测出的蛋白浓度都很高，最好应该在什么范围？上样量在多少比较好？2,：我用的碧云天普通的裂解液是否可以？核内蛋白能裂解出来吗？3：磷酸酶抑制剂用加吗？组织离心我用的是15000G，15MIN，可以吗？4：我做的蛋白是PKC和p38，老师能根据蛋白给点宝贵建议吗？做了好几次都没出来

================================

1、提取总蛋白即可
2、这个裂解液我不知道效果如何
3、如果做磷酸化蛋白需要加的
4、PKC与p38还是灰常好做的哈
裂解液需要的话
我可以给你点我的产品试试
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发表于 2013-4-3 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，我最近在做分子量是十几的蛋白，可是一直做不出来，一抗浓度是1：2000，二抗是1:2000。胶的浓度是15%，转膜条件是100mA, 60min。一抗是4度过夜，二抗是室温孵育1个小时。同样的膜上压出来的atin的效果很好。我想知道，做不出来的原因可能有哪些，有什么可以改善的地方。非常感谢

===============

目的蛋白是什么？
抗体哪里来的？
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发表于 2013-4-3 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师一个问题，我现在做Rat的肌肉组织，检测蛋白是GLUT4，用过santa和博士德的抗体，说明书上注明是50kd左右，但是现在曝光出来在43kd和34kd出现很明显的条带，压片很久才在55kd左右才会有条很弱的带，GLUT4应该是在肌肉组织里面是特异性的表达，其他人推荐我提取膜蛋白，因为GLUT4是在膜上表达，是不是蛋白在哪里表达就提取哪里的蛋白？
还有就是，我在同一张膜上面，上部分做80kd左右的蛋白，下部分做GLUT4，但是GLUT4曝光出来后出现竖条的背景，正常的条带应该是水平的一条，两个蛋白做的条件都是一样的，封闭是5%牛奶37°C 1h，一抗是4°C过夜，两者一抗来源是一样的，二抗是1：20000 室温1h。后来我将样本离心后再上样，还是出现竖条的背景，希望老师给点建议。谢谢

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1、GLUT4抗体，abcam有一个比较好用的
2、actin效果如何？放图上来
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发表于 2013-4-3 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，做了比较久的WESTERN了，但是有个问题一直搞不清楚。
某种蛋白的抗体比如说p53抗体（CST牌子），我做过，特异性很好。 但我不清楚，做出来的条带代表的是否有可能是突变型p53呢？ 抑或这是磷酸化状态的p53？ 请指教，谢谢
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发表于 2013-4-3 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

过表达的也没有出来，所以我怀疑是抗体出问题了。
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发表于 2013-4-5 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另一个问题，我一个朋友要做FGF23受体的抗体

但是我根本查不到这种抗体，只能查到FGF23的抗体，或者FGF 受体抗体

请问如何选择呢？
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发表于 2013-4-5 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做WB的新手， 想请教一下，老鼠股骨中提取蛋白的具体方法，提出的效果如何？
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发表于 2013-4-5 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位老师，你们好！最近做实验遇到两个个问题想请教下大家：1，你们一般都是用哪个公司的发光剂，我们这边的发光剂用起来都不怎么好使，麻烦你们给推荐几个比较好用的。2，昨天我们用一抗二抗去除液（强碱型）再用丽春红染色后发现条带变得很淡了，想问问大家有没有遇到过类似的情况，强碱可以减少PVDF膜上的蛋白么？谢了、、、
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发表于 2013-4-5 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
过表达的也没有出来，所以我怀疑是抗体出问题了。
系统稳定的情况下

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可能是抗体出问题了
不能下定论
还有几个因素要排除的
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