小中大请问,我最近做了些western,
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是:上样总蛋白75ug,配10%的胶,电泳时最小为10kd的marker还留着,PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过,封闭后一抗过夜。TBST洗膜,二抗1.5h,TBST洗膜。而后ECL显影。
内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21,bax,survivin都没有出来。
我仔细搜索了版内大家的讨论:
对于转膜时间和电流大小 没有一致的看法:有人认为半个小时,200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的,转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子,所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来,但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何?PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧?
我需要做怎样的调整。
我今天做,自己初步的调整如下:
1、胶配成12%
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少?
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Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h,注意降温