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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做的目的蛋白，一个很多杂带，一个背景很深，居然整膜都发亮，这两个都是一样的条件啊，老师您说过先确定二抗稀释度，我这两个用的二抗一样的，比例也一样的，结果却不同，是一抗的问题吗？封闭二者都是室温一小时，孵育一抗时间都是4度过夜的，谢谢

========================================

一抗的质量会影响背景与杂带
确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度
洗膜：一般是5分钟三次，可以延长到5min，6次
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发表于 2013-1-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做的目的蛋白，一个很多杂带，一个背景很深，居然整膜都发亮，这两个都是一样的条件啊，老师您说过先确定二抗稀释度，我这两个用的二抗一样的，比例也一样的，结果却不同，是一抗的问题吗？封闭二者都是室温一小时，孵育一抗时间都是4度过夜的，谢谢

===============

一抗
二抗洗膜都要增加
祝你实验顺利
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天 我跑了胶 做了考马斯亮蓝染色，我发现上样量要是很大（20ul），蛋白条带就呈有波浪样，越靠近下部越明显。我蛋白浓度是1-2ug/ul.帮我分析下吧！
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗的质量会影响背景与杂带
确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度
洗膜：一般是5分钟三次，可以延长到5min，6次
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我们洗膜一般都是10min，3次啊，有个抗体是Chemicon的多抗，背景很深，不知道是没摸对一抗稀释度，还是抗体有问题呢，条带还是有的。那么我用的都是一种二抗，难道不同的一抗，相同的二抗浓度吗？谢谢啊

[ 本帖最后由 flower-201 于 2013-1-30 15:46 编辑 ]
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发表于 2013-1-30 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们知道转膜后，丽春红染色判断转膜的效果，一般情况下泳道从上到下都是一些横条纹组成的，就比较好，但是我的转出来的效果没有明显的横条纹，分析应该是样品的原因，请楼主帮忙分析具体的原因与措施。
正常转膜的代表
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发表于 2013-1-30 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们洗膜一般都是10min，3次啊，有个抗体是Chemicon的多抗，背景很深，不知道是没摸对一抗稀释度，还是抗体有问题呢，条带还是有的。那么我用的都是一种二抗，难道不同的一抗，相同的二抗浓度吗？谢谢啊

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二抗我用的同一种的话都是相同的浓度
但是换了ECL的话是要换稀释度的
洗膜要多换液
稀释抗体的时候用封闭液
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发表于 2013-1-30 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下吧！

检查你的上样孔拔梳子的时候是不是不平整
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发表于 2013-1-30 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好的实片

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这样的膜能做出结果来确实不易
电泳后考马斯亮蓝染过胶吗？
我觉得你的电泳有问题
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发表于 2013-1-30 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
每次做实验的条件是一样的（配胶材料，样品，电泳条件等），为什么最近电泳时间变长，包括在浓缩胶和分离胶中，请教这可能是什么原因？
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问一下上样蛋白可不可以不经过煮沸这个程序，因为我怀疑我的蛋白在煮沸的过程中解聚了，由聚合形式转变为非聚合的。
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