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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-4-5 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，做了比较久的WESTERN了，但是有个问题一直搞不清楚。
某种蛋白的抗体比如说p53抗体（CST牌子），我做过，特异性很好。 但我不清楚，做出来的条带代表的是否有可能是突变型p53呢？ 抑或这是磷酸化状态的p53？ 请指教，谢谢

===================================================

这个需要与购买抗体的公司联系，看一下它这个抗体的抗原序列
要从序列开始分析
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发表于 2013-4-5 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另一个问题，我一个朋友要做FGF23受体的抗体

但是我根本查不到这种抗体，只能查到FGF23的抗体，或者FGF 受体抗体

请问如何选择呢？

======================

以FGF23 receptor查不到
这个名称对吗？
FGF23抗体是有的
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发表于 2013-4-5 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位老师，你们好！最近做实验遇到两个个问题想请教下大家：1，你们一般都是用哪个公司的发光剂，我们这边的发光剂用起来都不怎么好使，麻烦你们给推荐几个比较好用的。2，昨天我们用一抗二抗去除液（强碱型）再用丽春红染色后发现条带变得很淡了，想问问大家有没有遇到过类似的情况，强碱可以减少PVDF膜上的蛋白么？谢了、、、

==================

我们用Millipore的
货号：WBKLS0500
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发表于 2013-4-5 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我需要做的有 TGF-beta，VEGF,E-钙粘素，阿尔法-SMA，TAK1，NF-kB，COL-1和FN的WB，其中对于COL-1和FN买的是Abcam的抗体。不知道分子量大小是多少？总是查不到特别准确的。不知道前辈可否有经验？对于以上的指标检测有没有特别难度大的?
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发表于 2013-4-5 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我需要做的有 TGF-beta，VEGF,E-钙粘素，阿尔法-SMA，TAK1，NF-kB，COL-1和FN的WB，其中对于COL-1和FN买的是Abcam的抗体。不知道分子量大小是多少？总是查不到特别准确的。不知道前辈可否有经验？对于以上的指标检测有没有特别难度大的?

=======================

这些我都检测过
抗体好使的话没什么难度
分子量说明书没有吗？
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发表于 2013-4-5 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

亲，我是新手，想问问80v转120v电压时，蛋白的大小和胶的对应浓度之间的关系；而且有一种说法是300mA转膜的话，1kd等于1分钟，想确认这样的说法是否可靠；最后一问，santa的一抗，室温1h好一些还是4度过夜好一些。十分感谢！
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发表于 2013-4-5 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在在进行特定细胞器提取蛋白的试验，由于技术所限，每次得到的样品只有20-30uL，推测浓度在100ug/ml以下。
现在要做IP，肯定要求上样量一致，但是我们用BCA的Kit无法检测出样品浓度。试验组和对照组有细胞器含量的差异，因此也不能采取细胞数一致的方法来上样。
现在摸索着跑了几次IP，都有上样量的差异，求助！
另：我们实验室没有分光光度计....只有酶标仪
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发表于 2013-4-5 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好！我又来跟你请教问题了。我的目的蛋白还是没有做出来，现在是一点都做不出来了。我的实验条件如下：
电泳：80V浓缩胶，110V分离胶。
转膜:250mA 90min
5%脱脂牛奶封闭2小时
一抗：20小时
二抗：2小时
目的蛋白是29KD的，因为我提取的蛋白的浓度较低，所以为了保证40ug的上样量每次上样25ul。
请指教！
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发表于 2013-4-5 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好：我今天提了一批肝组织蛋白，强效裂解液，1：7.5提取的，测出的浓度还是很高，平均都在20ug/ul，如果按上样量100ug的话，上5ul就可以了吗？会不会有影响啊，这样的浓度我都不知道该咋办了，期待老师的意见
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 小中大
亲，我是新手，想问问80v转120v电压时，蛋白的大小和胶的对应浓度之间的关系；而且有一种说法是300mA转膜的话，1kd等于1分钟，想确认这样的说法是否可靠；最后一问，santa的一抗，室温1h好一些还是4度过夜好一些。十分感谢！

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1、一般我们转膜是300mA， 20KD以上的蛋白，每KD是基本上1min
2、一抗一般都是4度过夜
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