【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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6001

发表于 2013-4-5 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在进行特定细胞器提取蛋白的试验，由于技术所限，每次得到的样品只有20-30uL，推测浓度在100ug/ml以下。
现在要做IP，肯定要求上样量一致，但是我们用BCA的Kit无法检测出样品浓度。试验组和对照组有细胞器含量的差异，因此也不能采取细胞数一致的方法来上样。
现在摸索着跑了几次IP，都有上样量的差异，求助！
另：我们实验室没有分光光度计....只有酶标仪

=================

样品量太少，没辙

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6002

发表于 2013-4-5 10:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好！我又来跟你请教问题了。我的目的蛋白还是没有做出来，现在是一点都做不出来了。我的实验条件如下：
电泳：80V浓缩胶，110V分离胶。
转膜:250mA 90min
5%脱脂牛奶封闭2小时
一抗：20小时
二抗：2小时
目的蛋白是29KD的，因为我提取的蛋白的浓度较低，所以为了保证40ug的上样量每次上样25ul。
请指教！

===============

目的蛋白名称？

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6003

发表于 2013-4-5 10:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好：我今天提了一批肝组织蛋白，强效裂解液，1：7.5提取的，测出的浓度还是很高，平均都在20ug/ul，如果按上样量100ug的话，上5ul就可以了吗？会不会有影响啊，这样的浓度我都不知道该咋办了，期待老师的意见

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蛋白变性的时候要稀释样品，调整到2-4ug/ul

yjf1026[使用道具]
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6004

发表于 2013-4-5 10:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师，您说的再稀释是煮蛋白前还是煮蛋白后？麻烦了

avi317[使用道具]
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6005

发表于 2013-4-5 10:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的蛋白名称？

==========

AQP2

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6006

发表于 2013-4-5 10:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从外周血提的蛋白，分子量50kd，上样量30ug，50，100v电泳，200mA,1.5h湿转，5%脱脂奶粉室温封闭1.5小时，Abcam抗 1：1000TBST稀释（说明书上的图片推荐1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1小时。都是TBST洗膜3*10min，TBS洗膜1*10min。actin和目的条带还可以，可是背景特别深，还请各位高手指点迷津。

附件

2013-4-5 10:16

16887422.snap.jpg (19.09 KB)

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6007

发表于 2013-4-5 10:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

fangweibin119 wrote:
不会有影响
可以染色

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染过之后有的有红色条带有的没有他们都说蛋白的问题不大。。。。最近做还是曝不出来我做的是akt pakt您以前做过吗给点建议吧。。。。要崩溃了啊。。。

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6008

发表于 2013-4-5 10:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师，您说的再稀释是煮蛋白前还是煮蛋白后？麻烦了

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变性蛋白前

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6009

发表于 2013-4-5 10:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AQP2

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这个是膜蛋白
不是很好检测，抗体本身会有很大的原因

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6010

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小中大

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