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标题:【讨论帖】western blot问题解答

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
每次做实验的条件是一样的（配胶材料，样品，电泳条件等），为什么最近电泳时间变长，包括在浓缩胶和分离胶中，请教这可能是什么原因？

========================================

条件是一样
但是你能保证电泳缓冲液之类的试剂你没有换过？
看看配胶的储液有没有污染
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问一下上样蛋白可不可以不经过煮沸这个程序，因为我怀疑我的蛋白在煮沸的过程中解聚了，由聚合形式转变为非聚合的。

=================

如果你要做变性的话
应该要加热
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-1-30 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚学WB，我照导师说的用AP标记的二抗后在膜上显色以后膜还能用来显色吗？不敢为这个去问老师，只好来这里求助了！

我上次用AP标记的b-actin在膜上显色，我就是想在显色后的膜上再次显色，可不可以用上次用的NBT再次显色，如果可以的话用不用特殊处理。
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发表于 2013-1-30 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚学WB，我照导师说的用AP标记的二抗后在膜上显色以后膜还能用来显色吗？不敢为这个去问老师，只好来这里求助了！

======================

说具体点你要做什么啊
然后我才能告诉你怎么做
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发表于 2013-1-30 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
条件是一样
但是你能保证电泳缓冲液之类的试剂你没有换过？
看看配胶的储液有没有污染

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最近做了几次考染结果，发现蛋白条带在分离胶上部跑不开，不知道是什么原因？由于我发现现在的4%浓缩胶阻力特别大，溴芬兰条带要跑近2小时才进入分离胶，所以我怀疑可能是配胶的两种缓冲液出了问题，或是10%SDS溶液出了问题（这三种溶液是2月份配的），请帮忙分析下原因，谢谢！
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发表于 2013-1-30 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做了几次考染结果，发现蛋白条带在分离胶上部跑不开，不知道是什么原因？由于我发现现在的4%浓缩胶阻力特别大，溴芬兰条带要跑近2小时才进入分离胶，所以我怀疑可能是配胶的两种缓冲液出了问题，或是10%SDS溶液出了问题（这三种溶液是2月份配的），请帮忙分析下原因，谢谢！

=====================

10%SDS一般不会有问题
检查Tris-HCl的pH
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发表于 2013-1-30 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近半个月做WB，连B-actin 都出不来。之前用15%和10%的分离胶都试过bio-rad 半干转10v,15min ;10v 12min;10v 10min 丽春红染完后都有条带，就是具体的小条带不是很清晰。
后来又用12%的分离胶，北京六一厂的半干转仪器，按1mA/cm2 16mA转2小时，条带较之前有较清楚，但还是没有结果。actin拿给别人有做出来，我现在怀疑不知道蛋白有没有问题？膜用NC膜 小孔径的0.22um.一抗1：1000过夜，二抗1：1000 2h TBST洗膜3*10min.
期待您的答复，谢谢。
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发表于 2013-1-30 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白上样量是100ug
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发表于 2013-1-30 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
尊敬的楼主，您好！能否麻烦您帮分析一下以下结果，我采用封闭过夜，一抗和二抗各孵育1h。蛋白上样量为40ug。但是目的蛋白（85kd）和内参蛋白（39kd）总是很淡。非常感谢！
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 小中大
最近半个月做WB，连B-actin 都出不来。之前用15%和10%的分离胶都试过bio-rad 半干转10v,15min ;10v 12min;10v 10min 丽春红染完后都有条带，就是具体的小条带不是很清晰。
后来又用12%的分离胶，北京六一厂的半干转仪器，按1mA/cm2 16mA转2小时，条带较之前有较清楚，但还是没有结果。actin拿给别人有做出来，我现在怀疑不知道蛋白有没有问题？膜用NC膜 小孔径的0.22um.一抗1：1000过夜，二抗1：1000 2h TBST洗膜3*10min.
期待您的答复，谢谢。

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转膜时间调整：半干，1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜1h
别人能做出来说明你的蛋白没有问题
内参还是不容易降解的
调整你的一抗浓度
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