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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-31 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
骨关节炎

====================

你的这个蛋白比较新
我查了下抗体也很少
祝你实验顺利

=============================================================================

恩，是啊。
今天我用的是7.5%分离胶，跑浓缩胶70V，发现loading连成一片，这个是不是跟我上的量有关？
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-1-31 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有
分离胶选择8%，浓缩4%
电泳多跑一会
但注意把内参留住
转膜：湿转 恒流300mA 转膜2h

=============================================================================================================

对了，有一个问题我一直想咨询，就是转膜的时候海绵、滤纸、胶、膜的大小问题，是否应该是海绵>滤纸>胶>膜,滤纸比胶大很多是不是会造成短路，但实际转膜的过程中，我们发现滤纸大很多也没关系，还是能很好的转到膜上，所以说滤纸大小问题是不是不是那么关键。

另外，如果转膜的时候散热没做好，导致整个系统过热，对转膜有什么影响？条带会变散？转膜效率降低？
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发表于 2013-1-31 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1，抗血清容易有较高的背景，建议纯化抗体
2，适当延长封闭的时间
3，如果是刚开始做WB，建议先做内参
4，整个过程基本没什么问题
5，蛋白是磷酸化的吗？如果是用5%BSA-TBST封闭、孵育一抗二抗
6，确认Marker的位置，预染只能看大致的位置，确认位置应该用预染与非预染同时电泳染胶确定
good luck

==============================================================================

谢谢楼主的建议
其中一个用过纯化抗体，还是背景深
封闭是过夜4度封闭
没有内参
蛋白用在线工具分析有一个磷酸化位点，不知道是否有影响？请教楼主，磷酸化对WB有什么影响呢？
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发表于 2013-1-31 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，这张图也就是看最初的曝光胶片才能隐约看见条带，扫描以后就看不清了

另外，转膜后把胶又考染了，发现有条带，虽然比较淡，但是以前没有，转膜条件也没有变，只是上样量加倍了，请问楼主这是怎么回事，有影响吗？
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发表于 2013-1-31 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，我做的分子量是17kd的，β-actin是很正常的，但是目的蛋白没有显出来，以为是不小心剪掉了，于是重跑，10kd的marker距下缘三分之一就停了，还是没有，最有可能是什么原因？
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发表于 2013-1-31 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
骨关节炎

============================================================================

恩，是啊。
今天我用的是7.5%分离胶，跑浓缩胶70V，发现loading连成一片，这个是不是跟我上的量有关？

=======================================

loading中的溴酚蓝连成一片没有关系啊
上样量大小通过你测定的蛋白浓度可以知道啊
1mm的胶40ug左右是没有问题的
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发表于 2013-1-31 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对了，有一个问题我一直想咨询，就是转膜的时候海绵、滤纸、胶、膜的大小问题，是否应该是海绵>滤纸>胶>膜,滤纸比胶大很多是不是会造成短路，但实际转膜的过程中，我们发现滤纸大很多也没关系，还是能很好的转到膜上，所以说滤纸大小问题是不是不是那么关键。

另外，如果转膜的时候散热没做好，导致整个系统过热，对转膜有什么影响？条带会变散？转膜效率降低？

=========================

大小一致是最好的
在湿转中大小有差别没有关系
在半干转中大小尽可能一致
湿转一定要降温
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发表于 2013-1-31 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主的建议
其中一个用过纯化抗体，还是背景深
封闭是过夜4度封闭
没有内参
蛋白用在线工具分析有一个磷酸化位点，不知道是否有影响？请教楼主，磷酸化对WB有什么影响呢？

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从论坛的帖子及我自己的实际经验来看磷酸化的蛋白比较容易有背景
你用的是什么封闭液及稀释抗体的体系？
建议用5%BSA-TBS，Tween 0.1%
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发表于 2013-1-31 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，这张图也就是看最初的曝光胶片才能隐约看见条带，扫描以后就看不清了

另外，转膜后把胶又考染了，发现有条带，虽然比较淡，但是以前没有，转膜条件也没有变，只是上样量加倍了，请问楼主这是怎么回事，有影响吗？

=========================================

转膜条件不变的情况下你加倍了上样量
那么在相同的条件下蛋白肯定不可能完全转移过去
因为在相同点上的蛋白多了
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发表于 2013-1-31 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，我做的分子量是17kd的，β-actin是很正常的，但是目的蛋白没有显出来，以为是不小心剪掉了，于是重跑，10kd的marker距下缘三分之一就停了，还是没有，最有可能是什么原因？

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转膜条件是什么
多大孔径的膜？
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