蛋白质与蛋白组学

很简单
第一：电泳缓冲液污染（是不是反复使用了？）
第二：转缓应该新配

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你好，我是上面问那个问题的！就是显色的时候出现竖条带方格状的，有点不清楚为什么电泳缓冲液污染会造成这样呢？

最近在做western遇到一个奇怪的问题，检测细胞上清蛋白，actin泳道为细胞裂解，上清中没有杂到actin正常。目的蛋白为14kd,但是试验中检测到目的蛋白约24kd,而且买的标准品也在24kd上面有条带。而下面整个成一条线，但理论上目的蛋白大致在成一条线的位置，但是这又与实验处理相矛盾。因为只有右面4个泳道会有条带
1.蛋白偏大（24kd)是什么原因?
2.下面整个成一条线是什么原因照成（抗体是多抗）。
3.实验条件该怎样优化？
4.发表文章的话下面那整个一条线剪切掉可以吗？把其它地方背景减弱这属于学术不端吗？谢谢！

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1，蛋白偏大的话首先要确认你的Marker，你是用预染得还是非预染的？
确定准确的位置需要用非预染的Marker
2，多抗有可能会有多条带，可以通过加大上样量，减小一抗浓度来调整
3，当然可以减掉，你可以通过调整对比度来改变美观程度，这又不是作假！

大家好！
我们实验室最近遇到这样的问题：
实验条件：上样305ul/泳道，电泳：80V30min，120V70-75min。buffer14.4g甘氨酸，3.02gTris,10%SDS10ml，定容到1L。
预染Marker，170、130、100、72、55、40、33、*、14.4。
电泳过程中，溴芬兰指示标记进入分离胶很整齐，marker分离也没问题。随着电泳时间的增加，marker越来越淡，最后72及其以上的条带均丢失。
郁闷，同一个实验体系，这种现象时有时无。

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没碰到这样的情况
你的浓缩胶有多高？（从梳孔底部到分离胶界面之间的距离）

我想请教您一些问题：
关于蛋白marker，我用的是ferments的1811，有两条红色带的那种，跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶，在电泳的时候，marker只有40多及以上的能分开，28及以下的marker全都挤在一起，跑不开，即使是跑到底了也没有分开，跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题，后来重新滴定调整，也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白，但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开，明天就跑不开了，根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的，并没有大的变化。

谢谢您的指点。

28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少？
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离？

谢谢您的指点，
分离胶的高度很大，因为浓缩胶只在梳子以下一厘米，所以我也觉得很奇怪，不知道是哪里出了问题。

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不客气
我觉得问题还是出现在分离胶
你用15%的试了吗

请教一westernblot问题，上样时上样缓冲液的最终浓度应该是x 多少倍？我的总体系是20微升，因为我组织蛋白含量较高，组织蛋白体积为5微升，我该如何办？上样时蛋白的含量最好为多少？不胜感谢！

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样缓终浓度为1倍
以终体积20ul体系为列：你现在有组织蛋白5ul，加入PBS或者你的蛋白提取裂解液（最好选择裂解液）11ul，然后加入4ul 5倍样缓
如果你用的是2倍的样缓：你现在有组织蛋白5ul，加入PBS或者你的蛋白提取裂解液（最好选择裂解液）5ul，然后加入10ul 2倍样缓
上样量一开始选择40ug左右比较好，看预实验结果后再行调整
good luck

您好，想请教您个问题，无论加多大的抗体，出来的结果都在55KD的位置。考马斯染过之后，蛋白是完整的。请问是什么原因呢？谢谢！

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？？
重组蛋白？
不清楚你的意思

你好,我现在也要做bcl-2,我想问一下.1.提蛋白的试剂是用提总蛋白,还是用其它的.
2.一抗用rabbit抗人的,mouse抗人的有没有区别.3,你的二抗用的是什么标记的,效果怎么样.
谢谢!

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1，总蛋白提取试剂
2，rabbit一般为多抗（现在也有rabbit的单抗），小鼠的一般为单抗
区别主要在于二抗的选择
3，用HRP标记的二抗做的
效果还行吧，把邮箱给我可以发给你看看
我做的是骨骼肌

我在wb过程中发现 我的条带连在一起了 并且加marker的那孔中也有目的蛋白检出
我配置的蛋白胶是10%的
分离胶：
H2O 4ml
4XBuffer(Tris-SDS pH 8.8) 2ml
40%丙烯酰胺 2ml
10%APS 100ul
TEMED 10ul

浓缩胶：
H2O 2.5ml
4XBuffer pH6.8 1ml
40%丙烯酰胺 0.5ml
10%APS 40ml
TEMED 4ul

电泳100V
转膜 300mA 90min

我上样量为15ug总蛋白 差不多没孔是12ul左右
我觉得好像不是上样量的问题 以前没有遇到过这个状况
而且用了santa的抗体出现了两条带

我做了2次了 都是这样
请老师 在百忙之中指点迷津
万分感谢

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1，两条带的问题首先要看抗体如何，有很多多抗就会有两条带，看看说明书及相关文献发表的图片
2，延长分离胶的凝固时间
3，我个人认为上样量有些大，建议减半