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标题:【讨论帖】western blot问题解答

glass[使用道具]
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发表于 2013-1-31 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前辈您好
我这几天跑的条带 无一例外是白板 处于深度郁闷中
现提供操作步骤 请前辈指点
我做的是细胞蛋白的 HDAC4 VBGFR-1提取测定 根据平皿中细胞数量的多少 确定裂解液的量 用的是申能博彩的 未加干预的是70微升 裂解液 加了干预的 考虑到不少细胞凋亡 减少了裂解液的量
BCA法测蛋白 收集蛋白时 测的浓度是5点多 1点多微克每微升 后放在-80的冰箱里 后来测定 浓度都竟然升高 一师兄建议用裂解液稀释一下 后测得的浓度 在5左右 最大的10点多
蛋白质量是90微克 （是不是质量太大了）
下层胶我用的是8%的 上层胶是5%的
跑电泳是120V 110MIN
转膜是NC膜 转膜液的配置 10×trans biffer Tris 58g Gly 29g SDS3.7g 双蒸水定容至1000ml 用时 用10×母液80ml+甲醇160ml+双蒸水560ml 定容至800ml
转膜是120V 120MIN（蛋白分子量分别是180KD 140kd）冰盒降温
5%牛奶封闭摇床1小时 一抗（1：500 abcom）4度过夜
第二天 TBST 10MIN×3次洗
二抗（中杉 1：8000）孵育1小时 后 TBST 10MIN×3次洗
发光液是HYGLO的 曝光是在电脑控制曝光的
结果 是白板
去哦那个前辈指点 哪个需要改正
急盼
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发表于 2013-1-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前辈您好
我这几天跑的条带 无一例外是白板 处于深度郁闷中
现提供操作步骤 请前辈指点
我做的是细胞蛋白的 HDAC4 VBGFR-1提取测定 根据平皿中细胞数量的多少 确定裂解液的量 用的是申能博彩的 未加干预的是70微升 裂解液 加了干预的 考虑到不少细胞凋亡 减少了裂解液的量
BCA法测蛋白 收集蛋白时 测的浓度是5点多 1点多微克每微升 后放在-80的冰箱里 后来测定 浓度都竟然升高 一师兄建议用裂解液稀释一下 后测得的浓度 在5左右 最大的10点多
蛋白质量是90微克 （是不是质量太大了）
下层胶我用的是8%的 上层胶是5%的
跑电泳是120V 110MIN
转膜是NC膜 转膜液的配置 10×trans biffer Tris 58g Gly 29g SDS3.7g 双蒸水定容至1000ml 用时 用10×母液80ml+甲醇160ml+双蒸水560ml 定容至800ml
转膜是120V 120MIN（蛋白分子量分别是180KD 140kd）冰盒降温
5%牛奶封闭摇床1小时 一抗（1：500 abcom）4度过夜
第二天 TBST 10MIN×3次洗
二抗（中杉 1：8000）孵育1小时 后 TBST 10MIN×3次洗
发光液是HYGLO的 曝光是在电脑控制曝光的
结果 是白板
去哦那个前辈指点 哪个需要改正
急盼

===============================

上样量多少ug？
我觉得可能是你的蛋白没有提取出来
另外二抗你检测过吗？是什么标记的？
二抗浓度有可能太稀了
目的蛋白定位在那？
做过内参吗？
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发表于 2013-1-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢
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发表于 2013-1-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次 我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？
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发表于 2013-1-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

===========================

化学发光需要不同的二抗
另外需要暗室，胶片、压片盒等
如果没有暗室有仪器可以选择
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发表于 2013-1-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次 我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

====================================================================

建议加入buffer后就变性
变性后分装保存，可以分装成40多ul，上样时冻融一、两次对大部分蛋白没有影响
最好能分装成25ul左右，每次用一管
前期麻烦后期会省事
变性过的上样时我是不煮的
变性与降解不是一会是，变性后反复冻融会引起样品的降解
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发表于 2013-1-31 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢
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发表于 2013-1-31 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次 我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？
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发表于 2013-1-31 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
,我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

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化学发光需要不同的二抗
另外需要暗室，胶片、压片盒等
如果没有暗室有仪器可以选择
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发表于 2013-1-31 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次 我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

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建议加入buffer后就变性
变性后分装保存，可以分装成40多ul，上样时冻融一、两次对大部分蛋白没有影响
最好能分装成25ul左右，每次用一管
前期麻烦后期会省事
变性过的上样时我是不煮的
变性与降解不是一会是，变性后反复冻融会引起样品的降解
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