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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-31 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室只有BIO-RAD的TANK湿转系统。依您的经验，17KD转膜用恒流 电流和时间如何设置？

==================

0.22um膜
恒流 300mA，20min
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发表于 2013-1-31 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是我用1ul试过，连1：1000的点都没曝光出来，在确定试剂都没问题的情况下，当时我是怀疑1ul的抗体上样量太少造成的，所以我采用15ul试了下。你只要用1ul就可以了？那是不是说明我的二抗活性不好啊？

==================

是的
一、可能二抗活性不好
二、ECL的敏感性低
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发表于 2013-1-31 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
,我想问一下,如果一抗用的是rabbit抗人的.但是内参beta-actine用的是mouse抗人的,这样对实验有什么影响.是不是内参和一抗的来源一定要相同.谢谢,,
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发表于 2013-1-31 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好,我想问一下,如果一抗用的是rabbit抗人的.但是内参beta-actine用的是mouse抗人的,这样对实验有什么影响.是不是内参和一抗的来源一定要相同.谢谢,,

==========================

不用
选择不同的二抗就行
rabbit的选择抗rabbit的二抗
mouse的选择抗mouse的二抗
good luck
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-1-31 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我要检测10个样品，是应该一张膜上检测呢，还是分两次做呢？谢谢啊
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发表于 2013-1-31 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
肺癌
用BCA法测了样本的蛋白浓度，感觉好像不可信。帮我看看哪个条带的上样量比较合适。
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发表于 2013-1-31 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我要检测10个样品，是应该一张膜上检测呢，还是分两次做呢？谢谢啊

=================================

这要看你的胶有多少个孔了
如果是12孔的话当然可以在一张膜上检测
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发表于 2013-1-31 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用BCA法测了样本的蛋白浓度，感觉好像不可信。帮我看看哪个条带的上样量比较合适。

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各种蛋白浓度测定方法都有很多影响因素
电泳结果最能说明问题
不同物种之间，不同的细胞都不一样
我觉得你的这个电泳很漂亮，蛋白浓度稍微低了一些，但是已经很好了。
看你的目的分子量附近条带情况如何来确定你的上样量
如果WB想做漂亮（漂亮指内参一致的话至少要做2个月吧，按照我目前的水平）
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发表于 2013-1-31 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们这梳子都是10个孔的啊，还有12个孔的梳子吗，呵呵
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发表于 2013-1-31 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们这梳子都是10个孔的啊，还有12个孔的梳子吗，呵呵

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呵呵
有
还有25孔，30孔的
胶大小不一样
10孔的梳子你可以先摸好条件，然后10个样品一起做（但是有边缘效应，且没有Marker了）
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