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标题:【讨论帖】western blot问题解答

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-2-2 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教老师！我的目的蛋白18KD，二聚体30KD，跑了很多次都没有目的条带，10分钟时没有条带，30分钟以上则像考染一样都是杂带，内参压出来还可以。
条件：
分离胶12％，上样量40ug，1.5mm厚胶，100V电泳90分钟，250mA湿转2小时，考染见清楚条带，转膜后胶考染未见条带，未作丽春红染色。一抗，SANTA，1：200，二抗：1：5000。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗室温2小时，TBST洗2分钟，10分钟，10分钟，5分钟，5分钟，5分钟，二抗1小时，洗膜同上。ECL反应3分钟。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-2-2 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一下：0.22和0.45的PVDF膜都试过。
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发表于 2013-2-2 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上这样洗膜的原理是什么呢？我没有做过那么小蛋白，不知这个和蛋白大小有关还是实验室习惯？
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-2-2 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想向楼主请教如何简单快捷的得知蛋白是否降解？如果同时用丽染膜和考染胶没有目的蛋白所在位置的蛋白，是否可以结论降解了呢？有什么办法分辨是抗体不灵还是蛋白降解呢？非常感谢！
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发表于 2013-2-2 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-2-5 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
300mA 2h
转膜过程中注意降温
good luck

=====================================

请问老师，湿转是这个条件，那半干转呢？
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发表于 2013-2-5 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
心肌梗死

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请问抗体洗脱液的配方?我今天显影没显出,后用丽春红染色膜上有蛋白,有人说用抗体洗脱液洗脱然后从头加一抗,请问是这样的吗?洗脱液洗脱时间是多少?谢谢

=====================================

非常不好意思
配方是公司的秘密
我也没办法告诉你
可以告诉你一点的就是这个产品很好用
如果你有兴趣我可以告诉是哪个公司的产品
用短消息吧

stripping的时间由产品来决定
一般是37度 30min或者室温 1h以内
good luck
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发表于 2013-2-5 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问38KD和185kd蛋白的转膜条件，我用的是湿转，恒流，400mA,需要多长时间？谢谢

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建议用300mA，电流太大温度会很高
300mA 38K 40min
300mA 185K 2h
转膜过程中一定要降温
good luck
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发表于 2013-2-5 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢老师的回复。
今天又查了些资料，有个说道分离胶和浓缩胶高度问题，也可能会导致你需要的大分子蛋白跑不出来，也就是说分离胶矮了不行。老师一般做的时候浓缩胶分离胶高度是个什么比例呢？

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呵呵，是的
我常用有两种电泳槽
分子量大于150K的话我用高的分离胶，10cm左右
小于150K的用mini胶就可以
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duoduo[使用道具]
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 小中大
蛋白条带考染有清楚条带，不知道为什么爆光后的目的条带有三条，请问这是出现了什么问题？对你的回复不胜感激！

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首先调整一抗的浓度，2倍稀释再试试
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