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标题:【讨论帖】western blot问题解答

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-2-5 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-2-5 13:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

==========

呵呵
是有问题

老师推荐个样本处理体系和具体加法好么？谢谢了
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-2-5 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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一直都没有做出目的条带，请老师帮忙看看是哪里出了问题。先谢谢！！
从贴壁的细胞中提取蛋白，上样40ug-80ug都试过。跑胶后考马斯亮蓝染过，总蛋白条带均匀。转膜200mA，1h或100mA 2h或20mA过夜都试过，之后膜丽春红染色也能看见总蛋白的条带。封闭1h，一抗1：1000和1：500都试过，二抗1：1000，1：2500，1：5000都试过。DAB显色和ECL显色都试过，只有actin能显出来，目的蛋白125KD的一直没有显出来。请大家帮忙分析一下原因。谢谢大家了！！
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发表于 2013-2-5 14:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的下胶凝好后出现皱褶，请问怎么解决这个问题？谢谢
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发表于 2013-2-5 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那是抗体非特异？

=======================================================

用的是单克隆抗体，这样的情况属于正常和可以接受的范围吗？谢谢
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发表于 2013-2-5 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，我的目的蛋白的条带比较弥散，但位置是对的，调整电压可以改变吗？在同一胶上我帮别人做的条带很漂亮的，可能是什么问题呢？会不会蛋白不能用啦？感谢答复！
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发表于 2013-2-5 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主有没做过DNMT家族的WB?如果有 麻烦告知电泳和转膜的条件
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发表于 2013-2-5 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师推荐个样本处理体系和具体加法好么？谢谢了

=================

用5倍的还原样缓
具体配方上网查
呵呵
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发表于 2013-2-5 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
心肌梗死

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一直都没有做出目的条带，请老师帮忙看看是哪里出了问题。先谢谢！！
从贴壁的细胞中提取蛋白，上样40ug-80ug都试过。跑胶后考马斯亮蓝染过，总蛋白条带均匀。转膜200mA，1h或100mA 2h或20mA过夜都试过，之后膜丽春红染色也能看见总蛋白的条带。封闭1h，一抗1：1000和1：500都试过，二抗1：1000，1：2500，1：5000都试过。DAB显色和ECL显色都试过，只有actin能显出来，目的蛋白125KD的一直没有显出来。请大家帮忙分析一下原因。谢谢大家了！！

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125K的目的蛋白？
建议300mA湿转 1h50min
注意降温
另外你的蛋白的细胞定位是那？
不同定位的蛋白有时候提取会有些问题
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发表于 2013-2-5 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
阳萎

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我的下胶凝好后出现皱褶，请问怎么解决这个问题？谢谢

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减少APS及TEMED的量试试
可能室温较高
凝胶时间缩短造成
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发表于 2013-2-5 14:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用的是单克隆抗体，这样的情况属于正常和可以接受的范围吗？谢谢

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单克隆抗体也会出现非特异性条带
如果能准确确定你的目的蛋白位置
我认为是可以接受的
图挂上来看看
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