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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-5 14:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主，我的目的蛋白的条带比较弥散，但位置是对的，调整电压可以改变吗？在同一胶上我帮别人做的条带很漂亮的，可能是什么问题呢？会不会蛋白不能用啦？感谢答复！

======================================

如果是这种情况的话有可能是的目的蛋白降解
你的目的蛋白是糖蛋白？
别人的蛋白和你是一样吗？
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发表于 2013-2-5 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主有没做过DNMT家族的WB?如果有 麻烦告知电泳和转膜的条件

===============

呵呵
不好意思
没做过
不知道这个蛋白
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发表于 2013-2-5 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定 恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～
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发表于 2013-2-5 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定 恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～
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发表于 2013-2-5 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
125K的目的蛋白？
建议300mA湿转 1h50min
注意降温
另外你的蛋白的细胞定位是那？
不同定位的蛋白有时候提取会有些问题

============================================================================================================

每次转膜都是放在冰盒中转的。蛋白位于细胞质中，用的裂解液是碧云天的“Western 及 IP细胞裂解液”，不知道行不行。由于每次都是actin出来，所以感觉细胞提取不会出问题吧。呵呵，不知道对不对。谢谢！！
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发表于 2013-2-5 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，谢谢您的解答。我已经找到原因了，可能是我做的组织是小鼠的，而又用了小鼠的单抗，造成这种情况，我换了兔多抗，好多了，只是不知道原因，因为一抗的说明书上，是可以检测小鼠的，希望得到您的解答，谢谢！
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发表于 2013-2-5 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
心肌梗死
想请教，我的目标蛋白分别是33KD，27，19KD，用半干转，15V，45min，只有33的能出来，27和19的都不在膜上，考虑转过了，改14V,43min,转完后丽春红染色，27的能看到泳道，但没有蛋白带，19的连泳道都没有。考虑丽春红无特异性，继续一抗二抗孵育，结果没有一点发光的。考马染胶，没有残留。（另外一个问题，有时染的胶可以隐约看到泳道，没有蛋白条带，算是没转上吗？）
有没什么好方法可以提高小分子蛋白的转膜效率的？
一抗回收再利用，是放4度冰箱保存就可以吗？再利用时会不会因为抗体效价降低而要另外再加一些抗体呢？谢谢
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发表于 2013-2-5 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不可以
像Millipore的PVDF只能用无水甲醇活化
转缓中的甲醇也不能由其他试剂代替

==================================================

甲醇活化时间一般是多久呢？我们一般用是十几秒钟，可以吗？
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发表于 2013-2-5 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是这种情况的话有可能是的目的蛋白降解
你的目的蛋白是糖蛋白？
别人的蛋白和你是一样吗？

============================================================================================================

我们检测的目的蛋白一样，一起电泳转膜的，蛋白标本是不用模型的。之后又一次电压变低跑（因为时间的原因，当时有别的事情），我们的都弥散了。我是不是应该调高电压？谢谢！
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-2-5 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，你好，请问为了防止目的蛋白降解，能否在先将动物多聚甲醛固定后再取材呢？
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