蛋白质与蛋白组学

相关疾病：
心肌梗死

========================================================================

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定 恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

=================

300mA 40min

每次转膜都是放在冰盒中转的。蛋白位于细胞质中，用的裂解液是碧云天的“Western 及 IP细胞裂解液”，不知道行不行。由于每次都是actin出来，所以感觉细胞提取不会出问题吧。呵呵，不知道对不对。谢谢！！

====================================

细胞质中的蛋白提取应该没什么问题
actin能出来说明你的过程应该还是没有问题
提取蛋白的时候加入蛋白酶抑制剂了吗？
另外目的蛋白的一抗是什么厂家的？

想请教，我的目标蛋白分别是33KD，27，19KD，用半干转，15V，45min，只有33的能出来，27和19的都不在膜上，考虑转过了，改14V,43min,转完后丽春红染色，27的能看到泳道，但没有蛋白带，19的连泳道都没有。考虑丽春红无特异性，继续一抗二抗孵育，结果没有一点发光的。考马染胶，没有残留。（另外一个问题，有时染的胶可以隐约看到泳道，没有蛋白条带，算是没转上吗？）
有没什么好方法可以提高小分子蛋白的转膜效率的？
一抗回收再利用，是放4度冰箱保存就可以吗？再利用时会不会因为抗体效价降低而要另外再加一些抗体呢？谢谢

==========================================

1，换用0.22um孔径的膜
2，小分子不需要提高转膜效率哦
3，我不建议重复回收利用抗体，稀释比例不好控制

甲醇活化时间一般是多久呢？我们一般用是十几秒钟，可以吗？

===================

活化10至15s就可以了
之后用转环平衡

我们检测的目的蛋白一样，一起电泳转膜的，蛋白标本是不用模型的。之后又一次电压变低跑（因为时间的原因，当时有别的事情），我们的都弥散了。我是不是应该调高电压？谢谢！

======================

电泳用的是什么条件呢？

老师，你好，请问为了防止目的蛋白降解，能否在先将动物多聚甲醛固定后再取材呢？

============================

后续你要做什么？
用甲醇固定之后做WB会有问题的

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

===============================================================================================================

请问：我转膜结果用丽春红染色，往往是膜的中间三分之一区域（约100kD至50kD）有比较清晰的条带，而上下两块区域则不多，尤其是下面的三分之一（低分子量）条带很淡。这是怎么回事？ 我做脑组织，考马斯亮蓝染胶，条带很丰富；转膜后，胶也很干净。转移液是 192 m mol 甘氨酸、25 m mol Tris、10% 甲醇、0.04% SDS，130mA，7小时。目的蛋白约150KD，还可以杂出来，就是β-actin近来没杂出来或是条带很浅，为什么？

==========================================

同样的样品与抗体beta-actin你一直做的很好吗？
对于beta-actin来说转膜时间有点长了

相关疾病：
多发性硬化大动脉炎

====================================

细胞质中的蛋白提取应该没什么问题
actin能出来说明你的过程应该还是没有问题
提取蛋白的时候加入蛋白酶抑制剂了吗？
另外目的蛋白的一抗是什么厂家的？

=============================================================================================================

提取蛋白的时候加了PMSF，一般PMSF的浓度需要多少呢？一抗用过santa cruz的，但买的是分装的，没做出来。现在用的是凯基的，同样没做出来~郁闷ing~

相关疾病：
心肌梗死

=============================================================================================================

提取蛋白的时候加了PMSF，一般PMSF的浓度需要多少呢？一抗用过santa cruz的，但买的是分装的，没做出来。现在用的是凯基的，同样没做出来~郁闷ing~

==================================

1~3mM
在水溶液中（裂解液）降解时间是30min
超过30min要重新加入
你做的是什么蛋白？