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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-2-5 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳用的是什么条件呢？

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60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V
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发表于 2013-2-5 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V

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电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-2-5 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
cell signaling 的抗体一抗的起始稀释比例是1：1000（不同的抗体均不同：厂家，批次等）
我建议你做两个稀释度1：1000与1：2000的预实验
稀释比例的大小还要取决于二抗及ECL的敏感性
抗体稀释液最好用5%的奶粉或者BSA
与封闭液相同
你做的是磷酸化的蛋白，用BSA
good luck

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做磷酸化的蛋白，抗体必须用BSA稀释吗？用封闭液稀释可以吗？谢谢！！
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发表于 2013-2-5 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
心肌梗死多发性硬化

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1~3mM
在水溶液中（裂解液）降解时间是30min
超过30min要重新加入
你做的是什么蛋白？

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做的FAK，裂解时得在冰上裂解30min以上吧，之后还要重新加PMSF再离心吗？谢谢！！！
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-2-5 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温

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是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？
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发表于 2013-2-5 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在转膜1.5h后把电流调至250ma，但是发现没有转干净。谢谢您帮我分析一下吧。
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-2-5 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温

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是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？
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发表于 2013-2-5 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做磷酸化的蛋白，抗体必须用BSA稀释吗？用封闭液稀释可以吗？谢谢！！

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最好用BSA
你可以选择3%浓度的
CST说明书就是建议用封闭液稀释抗体的
4度过夜
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 小中大
相关疾病：
心肌梗死多发性硬化

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做的FAK，裂解时得在冰上裂解30min以上吧，之后还要重新加PMSF再离心吗？谢谢！！！

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FAK我做过
30min足够了
不用重新加
在裂解液细胞或者组织的时候加
PMSF与蛋白酶结合是不可逆反应
后续不用再加
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 小中大
是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？

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你前面是说电泳用300mA？
如果是的话电流太大了
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