蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  96/610 |‹‹‹949596979899100101102103›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
951

发表于 2013-2-5 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在转膜1.5h后把电流调至250ma，但是发现没有转干净。谢谢您帮我分析一下吧。

================

是电泳还是转膜啊
说清楚哦
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
952

发表于 2013-2-5 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请楼主指点一下130和180蛋白的电泳和转膜条件？
顶部
www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
953

发表于 2013-2-5 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V

==================================================

不好意思，我没有讲清楚，电泳60V---90V然后300ma 2.5h转膜
顶部
one[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73393
精华 0
积分 697
帖子 1114
信誉分 100
可用分 6353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
954

发表于 2013-2-5 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我使用的是Tubulin作为我的上样量标准。每次测完蛋白含量，我都是很小心的将所有蛋白稀释至相同浓度，然后上相同体积的样品跑sds-page电泳。但是每次做出来以后总是会发现条带并不均一。请问这是怎么回事吗？谢谢。
如图：
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
955

发表于 2013-2-5 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
心肌梗死

==========================================

请楼主指点一下130和180蛋白的电泳和转膜条件？

=================================

湿转
300mA 130K 为 1h30min
300mA 180K 为 1h50min或者2h
电泳用8%分离胶
4%浓缩胶
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
956

发表于 2013-2-5 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，我没有讲清楚，电泳60V---90V然后300ma 2.5h转膜

==============================

浓缩胶 90V
分离胶120或者150V溴酚蓝至底部
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
957

发表于 2013-2-5 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我使用的是Tubulin作为我的上样量标准。每次测完蛋白含量，我都是很小心的将所有蛋白稀释至相同浓度，然后上相同体积的样品跑sds-page电泳。但是每次做出来以后总是会发现条带并不均一。请问这是怎么回事吗？谢谢。
如图：

=================================================================================

变性后要用高速离心机做短暂的离心（也叫“甩一下”）
你的上样量有些大
降低上样量
其次，蛋白定量误差是很大的，你可以看文献，其实很多内参都是不一致的，内参只是一个校正的过程
如果要把内参做成肉眼看着一致的话要通过预实验后的内参条带的IOD值来调整上样量
呵呵
这需要好几次的实验才行
一般一个月差不多吧
good luck
顶部
987789[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
958

发表于 2013-2-5 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的样品浓度不够，做WB条带总是很弱，只比背景深一点点，想浓缩样品，请楼主和大家帮忙推荐个简便易行的浓缩办法，谢谢！
另外，请问楼主老师，扫描WB胶片的时候，有三个值可以调，貌似是明调值，暗调值和中间调值，请问文章中对这三个值的调整有什么要求吗？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
959

发表于 2013-2-5 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的样品浓度不够，做WB条带总是很弱，只比背景深一点点，想浓缩样品，请楼主和大家帮忙推荐个简便易行的浓缩办法，谢谢！
另外，请问楼主老师，扫描WB胶片的时候，有三个值可以调，貌似是明调值，暗调值和中间调值，请问文章中对这三个值的调整有什么要求吗？

========================

看你的扫描仪设置了
同一批图片设置相同就可以了
浓缩这一块我不懂
顶部
zranqi_1[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77471
精华 0
积分 409
帖子 497
信誉分 100
可用分 3298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
960

发表于 2013-2-5 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问怎么才能验证WEST的抗体和二抗是否已经失效
我的方法是直接把抗体和二抗混合加底物看是否显色，这种方法可行吗？
如果不可行还有更好的方法来验证WEST的抗体和二抗是否失效？
顶部
 6097  96/610 |‹‹‹949596979899100101102103›››|