蛋白质与蛋白组学

谢谢老师的解答。还有一个问题：转膜液里面甲醇和SDS应该怎么加？

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转环需要新鲜配制
SDS你可以用10%的储液稀释
甲醇一般是20%，直接加啊

请问老师，这样甩一下起什么作用？要多大的转速？我们用2000g甩10秒左右，够了吗？

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把变性时蒸发到EP管盖的水分甩下来
够了

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多发性硬化

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我是新手，想问问fangweibin119老师关于组织标本提蛋白的问题！
我每次取回来的标本一部分用75%的乙醇固定保存，一部分直接提蛋白！前者先做流式，然后剩下的也是提蛋白，不知道用固定后的细胞提蛋白会不会有什么不一样的！因为考虑到是组织细胞，所以我都是选用的1XSDS裂解液，觉得应该会裂解得强一点~！
我的方法是将固定的细胞悬液先也用PBS洗一遍，然后加1XSDS，也用超声超了的，冰上处理1小时左右，100度水浴10分钟，然后12000转离心10分钟，取上清，放入-80°冰箱保存~！
但不知道为什么我做了几次WB，过程什么的都是跟着师姐一起做的，所以应该没有问题~！因为她的都跑出来了~！但是我的每次常常连β-actin都不是很浓，甚至没有！想问问fangweibin119老师是不是我提蛋白有问题？是不是一定要加DTT和PMSF？谢谢！

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固定组织我没有提取过蛋白做WB
看过一些资料好像大家说可以做
PMSF肯定要加的
另外整个提取蛋白时间太长，容易降解

实验室有师兄说"中间值"必须调为零，其他两个值可以随便调，文章有这样的要求吗？

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每种仪器设备不同
你可以用普通的扫描仪扫描胶片就行
后面用软件读数

1，那是不是30min后还需再补加PMSF？
在裂解液细胞时加入到裂解液中，加入PMSF后马上加到细胞中，不需要再补加。但是如果裂解液（没加入细胞）放置超过30min时要重新加入PMSF才能继续提取细胞
2，上样量40ug，转膜：湿转 300mA 恒流 时间 1h50min或者2h
一抗是santa的，稀释比例忘了。二抗也是santa的，ECL 国产

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谢谢！您在做FAK的时候纯化了吗？还是就直接提的细胞中的FAK来做？

Pierce的ECL我了解
三种我都在用
我的意思是加大总蛋白的上样量
另外一抗不要用回收的（回收的一抗不知道它的确切浓度会成多少）
你还可以试试Pierce的膜蛋白提取试剂盒

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一抗不回收岂不是很浪费啊，每次就用15ul~

谢谢！您在做FAK的时候纯化了吗？还是就直接提的细胞中的FAK来做？

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没做纯化
做的是骨骼肌来源的

一抗不回收岂不是很浪费啊，每次就用15ul~

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呵呵
那你可以试试回收利用

我也请教一个问题：
图中下面的是内参，有总蛋白、浆蛋白和膜蛋白，上面的是同一块胶跑出来的目的蛋白，但每次都是一条细细的直线，并且这条直线正好在我目的蛋白的地方（70KD左右），但我怀疑这不是我需要的目的蛋白，因为根据下面的内参来看，蛋白并没有融合在一起，那这直线究竟是什么东西呢？怎样才能消除掉呢？我用的4%的浓缩胶和8%的分离胶，Marker跑得还可以。剪开膜后才分开敷的一抗二抗。所有试剂是跟别人一起用的，他们做都没问题。
另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？
谢谢！

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那就是你自己操作有问题了
问问你的同学