北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
bbcodeurl('http://www.agela.com.cn/UserFiles/表1双氰胺的信息.jpg', '%s')
1.2 实验步骤
称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。
注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。
1.3 实验条件
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）：
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
B：乙腈；
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。
表2 流动相梯度程序
parsetable('', '', '[tr][td]时间，min[/td][td]A%[/td][td]B%[/td][/tr][tr][td]0[/td][td]10[/td][td]90[/td][/tr][tr][td]0.4[/td][td]50[/td][td]50[/td][/tr][tr][td]1.8[/td][td]50[/td][td]50[/td][/tr][tr][td]1.9[/td][td]10[/td][td]90[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]10[/td][td]90[/td][/tr]')
*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
（2）质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。
表3双氰胺质谱信息
parsetable('', '', '[tr][td]
药物名称[/td][td]
监测离子对[/td][td]
DP[/td][td]
EP[/td][td]
CE[/td][td]
CXP[/td][/tr][tr][td]双氰胺[/td][td]
85.1/68.1[/td][td]71[/td][td]10[/td][td]41[/td][td]6[/td][/tr][tr][td][/td][td]85.1/43.1[/td][td]71[/td][td]10[/td][td]41[/td][td]6[/td][/tr]')
注：带“____”的监测离子对为定量离子对。
2.结果与讨论
2.1 高效液相色谱法：
2.1.1双氰胺的液相色谱图
bbcodeurl('http://www.agela.com.cn/UserFiles/图1双氰胺1µgml标准溶液的液相色谱图.jpg', '%s')
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：
表4 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）
parsetable('', '', '[tr][td]名称[/td][td]保留时间[/td][td]线性方程[/td][td]相关系数[/td][td]最低定量限（S/N=10）[/td][/tr][tr][td]双氰胺[/td][td]5.57min[/td][td]Y=108.16X+27.827[/td][td]0.9971[/td][td]0.5µg/g[/td][/tr]')
2.1.3准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5 表5 0.5µg/g添加回收实验结果（HPLC法）
parsetable('', '', '[tr][td]平行1[/td][td]平行2[/td][td]平行3[/td][td]平均值[/td][td]RSD[/td][/tr][tr][td]82.3%[/td][td]85.5%[/td][td]89.1%[/td][td]85.63%[/td][td]3.97%[/td][/tr]')
bbcodeurl('http://www.agela.com.cn/UserFiles/图2-3(1).jpg', '%s')
2.2 LC-MS/MS法
2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图
bbcodeurl('http://www.agela.com.cn/UserFiles/图4双氰胺10ngml标准溶液质谱图(1).jpg', '%s')
2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6： 表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）
parsetable('', '', '[tr][td]名称[/td][td]保留时间[/td][td]线性方程[/td][td]相关系数[/td][td]最低定量限（S/N=10）[/td][/tr][tr][td]双氰胺[/td][td]2.25min[/td][td]Y=3859.1X+23694[/td][td]0.9900[/td][td]2ng/g[/td][/tr]')
2.2.3准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 10ng/g添加回收实验结果
parsetable('', '', '[tr][td]平行1[/td][td]平行2[/td][td]平行3[/td][td]平均值[/td][td]RSD[/td][/tr][tr][td]82.5%[/td][td]83.5%[/td][td]89.3%[/td][td]85.2%[/td][td]4.31%[/td][/tr]')
bbcodeurl('http://www.agela.com.cn/UserFiles/图5-6.jpg', '%s')
3.产品订货信息
parsetable('', '', '[tr][td]
产品名称[/td][td]
规格型号[/td][td]
货号[/td][/tr][tr][td]新一代MAS-QuChERS-双氰胺净化管（填料量加大，更适合婴幼儿奶粉等复杂样品）[/td][td]500mg/15mL，50支/包[/td][td]MS-SQA02[/td][/tr][tr][td]MAS-QuChERS-双氰胺净化管[/td][td]100mg/2mL，50支/包[/td][td]MS-SQA01[/td][/tr][tr][td=1,2]Venusil HILIC液相色谱柱[/td][td]4.6*250mm，5μm，100Å[/td][td]VH952505-0[/td][/tr][tr][td]2.1*150mm，5μm，100Å[/td][td]VH951502-0[/td][/tr][tr][td]微孔滤膜[/td][td]0.22μm，直径13mm, 200/Pk[/td][td]AM021320[/td][/tr][tr][td=1,2]双氰胺对照品[/td][td]500mg /瓶，含量≥99.0%[/td][td]DCD-0001[/td][/tr][tr][td]1g /瓶，含量≥99.0%[/td][td]DCD-0002[/td][/tr][tr][td]离心管[/td][td]50mL，带螺纹盖，25个/包[/td][td]LXG0050[/td][/tr][tr][td]一次性注射器[/td][td]5mL,100/pk[/td][td]ZSQ-5ML[/td][/tr]')
相关方法：奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法） 
