激光扫描共聚焦显维镜定量分析注意事项

一、制备高特异性和高效价的荧光抗体
  
     标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测.制备高特异性和高效价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与高效价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定,主要是进行特异性和敏感性鉴定。
  
二、标本制作要求

1.标本厚度  组织切片或其他标本不能太厚,否则激发光多数消耗在标本下部,而物镜观察的上部不能被充分激发。
  
2.载玻片  载玻片要光洁,无自发荧光;载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,太厚会吸收较多的光,不能使激发光在标本上聚焦。
  
3.封固剂  甘油必须无色透明,无自发荧光。由于荧光在pH 8.5~9.5时较亮,不易很快退去,常用甘油加入0.5mol/lpH 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。
  
三、定量研究的要求

1.随机性
(1)在感兴趣区域内随机抽样,不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”,这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。
(2)在随机抽取的切片上,应随机抽取观察视野。
(3)在随机抽取的视野中,通过连续观察“光学切片”,得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”,需要在Z轴方向随机抽样,然后作定量研究。
  
2.避免参照陷阱  如果获得的资料是密度信息,当比较各组参照空间(包含待测结构的区域)的体积不同时,根据密度信息可能得出错误结论。因此,需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。