细胞世界

采用的是二步酶消化发分离鸡胚胎成骨细胞，一个月了一直不成功。分离出来的细胞一直不贴壁，培养两天后还没有呈现网状。不知道是什么原因。诚心请教各位有经验的朋友帮忙指点一下。我的具体操作如下：

1、取17日龄胚蛋，在75%乙醇中浸泡10min。于无菌操作台中，有气室的一头开洞，取出颅骨浸于Hanks中。
2、仔细去除结缔组织，再用hanks洗涤干净。
3、讲洗好的颅骨置于培养皿中，加入适量0.25%胰酶（Hyclone）于37℃消化20min，用吸管轻轻吹打2min。
4、加入完全ＤＭＥＭ（１０％胎牛血清）终止消化，弃去消化液，用ＰＢＳ清洗１次，再将骨片剪碎成１ｍｍ２，加入适量二型胶原酶（２ｍｇ／ｍＬ，ｓｉｇｍａ二型胶原酶溶于不完全培养基中），于37℃消化６０ｍｉｎ，期间不时晃动。
５、消化完毕后，吹打２ｍｉｎ，然后待骨片自然沉降，取上清，加入ＤＭＥＭ完全培养基混合，１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ离心收集细胞；用ＤＭＥＭ完全培养液重悬并接种于培养瓶中培养

谢谢各位了