蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 57  2/6 ‹‹123456››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

算盘阿星[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103469
精华 0
积分 154
帖子 67
信誉分 100
可用分 1051
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
11

发表于 2013-4-5 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白降解用何种办法可以准确的测出来？是不是一抗的问题呢？
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
12

发表于 2013-4-5 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你提供的信息不足以分析你的原因,如果有时间请将下面粗表填全,以便于应助战友充分了解信息.是我临时写的粗表,相对烦琐可能还不算实用,以后我会改进一下的,不好意思.

斑竹如果看中的话可组织力量完善,以便于战友应助.

目的蛋白名称： ；分子量： kd
样本组织/细胞名称：
目的蛋白表达亚定位（胞膜/胞浆/胞核/分泌型）： ；提取蛋白（胞膜胞浆/胞核/培养上清或血浆/总蛋白）：
一抗品种（普通多抗/单抗/纯化多抗）： ；一抗公司（最好有货号，便于网上查说明书）： ；一抗质量评价（贮存时间，是否做出来过）：
分离胶浓度：
加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：ug
转膜方式（湿转/半干） ；转膜强度（恒压/恒流）×时间
封闭液名称(5%牛奶TBST/3%BSATBST等等)： ；封闭温度和时间：
一抗说明书推荐稀释度： ；实际使用稀释度： ；一抗反应温度和时间：
二抗说明书推荐稀释度： ；实际使用稀释度： ；二抗反应温度和时间：
洗膜时间×次数：
显色（时间）/显影（压片时间）：
结果描述:
具体的问题：
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
13

发表于 2013-4-5 14:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #12 mamamiya 的帖子

谢谢你，mamamiya 师兄，非常感谢您能救小弟于危难之中！我把师兄制作的表填了填，师兄和诸位高手帮着分析分析！
目的蛋白名称： ；分子量：98kd
样本组织/细胞名称：大鼠背根神经节组织
目的蛋白表达亚定位（胞膜/胞浆/胞核/分泌型）： ；提取蛋白（胞膜胞浆/胞核/培养上清或血浆/总蛋白）：胞膜；
一抗品种（普通多抗/单抗/纯化多抗）：单抗 ；一抗公司（最好有货号，便于网上查说明书）：上海***公司代理的以色列阿罗们公司的产品 ；为抗trpv4离子通道蛋白的抗体
一抗质量评价（贮存时间，是否做出来过）：自从开始做western blot，从未作出来过。
分离胶浓度：
加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：20
转膜方式：湿转 ；
转膜强度（恒压/恒流）×时间：200mA 2.5小时
封闭液名称(5%牛奶TBST/3%BSATBST等等)：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：室温2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：200 使用稀释度： 1：200；一抗反应温度和时间： 室温 2小时
二抗说明书推荐稀释度：1：1000到1：3000 ；实际使用稀释度：1：1500 ；二抗反应温度和时间：室温2小时
洗膜时间×次数：洗三次，分别为10分钟、5分钟、5分钟
显色（时间）/显影（压片时间）：用DAB 显色
结果描述:没有出现目标条带，只出现分子量为其一半左右的3条带（45kd左右），内参跑得很漂亮
具体的问题：不知道是目标蛋白降解了，还是一抗在运输过程中发生问题，或是一抗的来源有问题，还是我的实验步骤有误
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
14

发表于 2013-4-5 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-4-5 14:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你提供的信息不足以分析你的原因,如果有时间请将下面粗表填全,以便于应助战友充分了解信息.是我临时写的粗表,相对烦琐可能还不算实用,以后我会改进一下的,不好意思.

斑竹如果看中的话可组织力量完善,以便于战友应助 ...

这种蛋白是种离子通道蛋白，叫做trpv4蛋白
顶部
dream2013[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103463
精华 0
积分 250
帖子 200
信誉分 100
可用分 1806
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
15

发表于 2013-4-5 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-4-5 14:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



这种蛋白是种离子通道蛋白，叫做trpv4蛋白

我没做过你的蛋白，只提供一般分析：
目标蛋白降解判断见前文考染（你内参好，问题不大）
还是一抗在运输过程中发生问题（很少发生），
或是一抗的来源有问题（可能是蛋白表达量低，没有被检测到，若是表位在蛋白提取中破坏则没有办法，但发生不多）

你没写胶浓度，不过看你marker似乎在10％左右，98kd的，建议可以6~8％（注意迁移谱会改变许多，要marker定）,这样有利于转膜。你组织量很少，所以蛋白量不多，但似乎20ug太少。你没写加样孔底面积，但从条带上看似乎是4～5mm宽的，按你厚度1mm算，你摸条件（不要做多，2孔即可）分别用用标准上样量（极限上样量的一半）和极限上样量（见一楼注4）做。你单抗，见一楼注16，不知你裂解液会不会破坏表位。你基本没背景，所以我下面是我的建议，主要是提高信号强度，只写有改变的

加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：标准+极限两孔足够（如果蛋白不够则任取其一，只做1孔）
一抗 使用稀释度： 1：100，反应温度和时间： 4度过夜（即>6h）
二抗实际使用稀释度：1：800 ；
洗膜时间×次数：洗三次，均为10分钟
顶部
算盘阿星[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103469
精华 0
积分 154
帖子 67
信誉分 100
可用分 1051
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
16

发表于 2013-4-5 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我犯了一个严重的错误，就是在当初使用抗体时，没有研究清楚抗体的说明书，从师兄那儿直接拿来就用了，结果今天才发现自己犯了一个大错，这种抗体是种多克隆抗体，而且当初说明书上并未告诉我们哪一条是目标条带，（说明书样品图见下），实际上这种抗体可以在杂交瘤上显现出六七条目标带，真是郁闷，特异性这么差，最终表达出来的只有一些非目标的条带，而目标条带却由于表达量少而不显色，真是一招不慎满盘皆输！诸位战友一定要引以为鉴，实验每一步都要谨慎哪！！
顶部
dream2013[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103463
精华 0
积分 250
帖子 200
信誉分 100
可用分 1806
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
17

发表于 2013-4-5 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思,上次弄错成TRPV1了,这次改过来了.

附件附的只是一个western的推荐操作而已,并非抗体说明书.而且它建议上样量50ug.
我不贴图了,这是说明书网址 cuturl('http://www.alomone.com/p_postcards/database/326.htm') ,提示表位仅19个AA（可能容易破坏，或产生非特异性），但其上显示的是~65kd 的主条带,其他几条带中~100kd的可能是前体，小的可能是其他减切片段或非特异性，你可以查查相关资料,至于哪一个与你课题有关我也不晓得，你要查资料。你说的98kd是它的前体（Molecular weight: 98010 Da [This is the MW of the unprocessed precursor]，见 cuturl('http://ca.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?Q9ERZ8') ）。
这是SIGMA公司的相同的抗体,见
cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/T9075dat.pdf')
其上也没有说分子量.
这是santa cruz的抗体说明书,也没有说分子量
cuturl('http://www.scbt.com/Datasheets_list/sc-16485.pdf')
你可以查阅各个抗体说明书后的参考文献确定trpv4的western blot相关信息。
Abcam、CELL SIGNALING 、BD、R&D都没有相关抗体。
下面这篇免费文献可能对你有一定的帮助：
cuturl('http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/13/11520?ijkey=7a170dd6904b24ce91af09ed2d0b1ba8648bbf03')
顶部
zranqi_1[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77471
精华 0
积分 409
帖子 497
信誉分 100
可用分 3298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
18

发表于 2013-4-5 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请教一个有关抗体选择的问题.对于同一种蛋白的抗体,试剂公司一般回有几种针对它的抗体:比如针对C-末端.或者是N末端的,还有的写着是R-14(against a peptide mapping wethin an internal region of the protein of human origin),尤其是最后一种是什么意思?我不理解.在选择买哪种抗体时该如何选择?还请各位多指教!
顶部
dream2013[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103463
精华 0
积分 250
帖子 200
信誉分 100
可用分 1806
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
19

发表于 2013-4-5 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一个有关抗体选择的问题.对于同一种蛋白的抗体,试剂公司一般回有几种针对它的抗体:比如针对C-末端.或者是N末端的,还有的写着是R-14(against a peptide mapping wethin an internal region of the protein of human origin),尤其是最后一种是什么意思?我不理解.在选择买哪种抗体时该如何选择?还请各位多指教!

=============================================================================================================

你的问题可能超出我的能力范围，因为我对抗体的制备方法并不熟悉。我想你查的是不是santa的说明书？那上面也是这么标的，我没遇到过你的问题，也没有咨询过他们的技术员，但我大体给你回答一下吧，要你自己去确认或者请抗体制备的高手来确认。
我找了一个抗体说明书，是C3的，和你说的情况差不多，见：
cuturl('http://www.scbt.com/Datasheets_list/sc-31299.pdf')
其上说法如下：C3a/α (R-14) is an affinity purified goat polyclonal antibody raised against a peptide mapping within an internal region of C3 of human origin.我的理解如下：
1 是山羊源亲和纯化多抗
2 抗体表位是用人C3分子内部的某一肽段来制备产生并纯化的（但不局限于人，说明书会详介其种属）
3 价格比一般抗体要贵。

你也可以查查其他抗体公司，看有没有针对你目的蛋白的抗体，然后看他们怎么说。
顶部
kuohao17[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77299
精华 0
积分 559
帖子 716
信誉分 101
可用分 4453
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
20

发表于 2013-4-5 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于加ECL比例加错了,重新用T-TBS洗膜两次,每次十分,再压片,但片子没任何印记
想问错在何处,谢谢
顶部
 57  2/6 ‹‹123456››