【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

由于加ECL比例加错了,重新用T-TBS洗膜两次,每次十分,再压片,但片子没任何印记
想问错在何处,谢谢

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这种办法我也干过，一般来说用你这种办法第二次加底物后信号强度会减少一些（其机制我并不清楚，可能是酶活减弱？但似乎不会这么快的），最多减为一半左右，很少有从有到无的质的改变。因为有时信号强时我前一天做的片子在第二天重做另一抗体（一、二抗都是没有交叉的，排除了重新杂交的干扰）时第一天的甚至还可以看到荧光。所以关键的问题不是你这一步操作的错误。从你给的信息看不出有什么直接导致你结果的错误。其可能原因纷杂，我不太好判断，而且前帖已有论述，不在此赘述。但底物对酶活的影响很小，无论是谁出现在正好质变的那点都是小概率事件，不是首要考虑的，而应该是排除其他更加可能的原因之后再考虑的。一句话，你这步操作错误的可能性极小。

xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请问一下由于压片时间没有掌握好，导致片子模糊不清，想重新利用PVDF膜再次显影压片，不知道此种方法是否可行，如果可行，最长的时间能够相隔多久？而且一次压片几张的时候，在同一片盒中的几张胶片是否需要隔开呢？谢谢

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可行，以下是3种非标准做法，你可以按顺序选择，会干扰定量的准确度（程度也不是很高，相对还是可信的），非万不得已不要用

1 不加抗体再次压片：先用TBST简单洗一下膜去除废底物。时间根据你HRP含量而定，一般强的话可以1～2天都没问题，但信号肯定会不同程度的减低

2 重新加（重新封闭加一抗可省，也可选择）二抗孵育（我推荐重加二抗是做过1后的首选或者是三种做法中的首选，应该说是干扰较小而效果较好的），然后行后续。效果会提高一些，时间比1也会延长一些，应该说我们压片子的后的膜都适用。如果加一抗则同3

3 洗脱后（用stripping buffer）重新封闭行后续，时间为正确保存的膜（如干膜或TBST4度贮存的膜或压片子的后的膜）至少半年以上有效，但会导致不均匀洗脱，某些公司正在开发均匀洗脱液但至今仍未有通过。效果与洗脱强度有关。总体评价是三者中最好的。

”同一片盒中的几张胶片是否需要隔开呢“是什么意思？如果说是同一张膜上压的片子贴在一起就行，不要隔开，注意片子要干燥，压前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起了。取时用手轻轻佛过就可以把片子与下面一张分开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想请教一个问题：
我上了9个样，染膜的时候染的很好，为什么曝光的时候有时总是只有一条或者两条带有荧光，曝光的时候也只能爆出一条或者两条？？？？？？
是一抗或者二抗没孵匀还是什么原因？？？
请多指教！谢谢！！

junhun[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能原因
1 表达本来就有差异，低的不在检测敏感范围之内
2 转膜不均偶发生在半干转膜的中间位置，染膜对比可确认。解决为增厚滤纸（上下各6层）稳定体系
3 孵育不均多发生于膜的周边部分证明：同一样本上同样量的若干孔行后续。解决：用转盘效果会高。若为封口膜水平摇床注意不要封的太死要留足空间使牛奶能够运动并有蛋白的面靠上接触牛奶
4 底物加到膜上铺的不均匀，以及荧光耗竭或不足，不在赘述。

3的可能性还是比较大的。上面几点你都注意一下。同时注意曝光的技巧。

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请dream2013来帮我分析一下我的这个时虚,时实的情况

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图很漂亮。
最大特点：这个图是对称的，中间不好，而与目的蛋白量多少无关。

首先排除转膜不均和抗体孵育不均。
重点考虑显影液和定影液以及显影定影技术是否过关，尤其显影液。
如果此片曝光10秒以内，则极有可能是信号过强和压片时间短的问题，采用降低抗体延长压片解决。否则可排除。
暂不考虑蛋白降解和上样量不妥以及抗体质量问题和封闭问题。

avi317[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图很漂亮。
最大特点：这个图是对称的，中间不好，而与目的蛋白量多少无关。

首先排除转膜不均和抗体孵育不均。
重点考虑显影液和定影液以及显影定影技术是否过关，尤其显影液。
如果此片曝光10秒以内，则极有可能是信号过强和压片时间短的问题，采用降低抗体延长压片解决。否则可排除。
暂不考虑蛋白降解和上样量不妥以及抗体质量问题和封闭问题。

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有个问题，与显影液会有怎样的关系呢?
这种问题不一定出现在中间,也不一定出现这么多泳道,而且也是最近才出现的问题.
我觉得有可能是转膜时,膜与胶在有些部位贴得不紧造成的.
抗体浓度应该没有问题,这个工作浓度已经使用过很长时间了,一直都很正常,不过显影液确实是新配的.

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

既然大家都认为首先是转膜的问题，那么可以选择相应的验证方案，简单并可确诊的就是丽春红染。
没有怀疑你的抗体浓度，只是你的膜很长，有可能引起孵育不均，先排除上面的再考虑这个。

显影液的问题主要是效率不足导致定影后正常条带的边缘也出现模糊而非锐利，这一点容易与信号过强引起的条带粗大并且周围模糊相混淆。

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我想请问我做蛋白的差异表达，但做出来差异不明显。因为之前做过基因芯片是有差异的，所以我想排出人为因素造成的差异不明显，可以给我系统讲一下吗？
我初步分析是：一抗二抗浓度时间相应降低，相较而言二抗的效果更明显？所以可以先不动一抗，变变二抗浓度。蛋白上样量增加是否会增加差异？显影曝光时间的缩短。
谢谢！

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 14:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先必须明确mRNA和蛋白中间隔着一个翻译过程，还有蛋白酶解，蛋白亚细胞分布和蛋白提取，上样都是影响因素。
如果是条带粗大引起的，那么降低抗体可以使条带漂亮。提到的降低信号的方法都可以。
如果本身就没有差异，那么也没有方法。

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