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标题:【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请dreanm2013来帮我分析一下我的这个时虚,时实的情况

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这个问题我也碰到过，我想这个与压片的关系不是很大，因为对同一张膜，我压过好几次，不管时间长短都没法改变这种虚实的情况，显影液也没问题，因为在此片前后压的片都很正常，这种虚实的情况并不常见，我想这种情况可能的原因是，凝胶不好，电泳过程中，蛋白弥散？或是如版主所说，转膜质量出现了问题（并不是转没转上的问题）？
我觉得这个问题出现的偶然，可以再重复一次，看是否还回出现这样的情况，当然在重复的过程中尽量排除一些可以避免的误差。
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lgm[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题我也碰到过，我想这个与压片的关系不是很大，因为对同一张膜，我压过好几次，不管时间长短都没法改变这种虚实的情况，显影液也没问题，因为在此片前后压的片都很正常，这种虚实的情况并不常见，我想这种情况可能的原因是，凝胶不好，电泳过程中，蛋白弥散？或是如版主所说，转膜质量出现了问题（并不是转没转上的问题）？
我觉得这个问题出现的偶然，可以再重复一次，看是否还回出现这样的情况，当然在重复的过程中尽量排除一些可以避免的误差。

============================================================================================================

非常感谢您的看法,我们做实验的总是兼听则明嘛.
实际上实验我是重复过的,如果出现模糊的现象,每次出现的区域和区域的大小都是不同的,我也曾经怀疑过是凝胶的原因,非常谢谢甜甜桂香的建议!
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any333[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请版主和各位战友帮我分析一下失误之处及原因

目的蛋白名称：MMP-2；分子量：63kd; Actin；分子量：43kd
样本组织名称：大鼠肾脏
一抗品种（多抗）：MMP-2,sc-10736; Actin,sc-7210, Santa Cruz
一抗质量评价：2周前还能做出结果，自从新购买1，2抗后，未再做出结果，1抗未变。
分离胶浓度：10%
转膜方式：湿转 ；
转膜强度（恒压）×时间：110 V，50 min
封闭液名称：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：37度2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：50-500; 使用稀释度:1：500; 一抗反应温度和时间: 室温 2h/室温1h+4度过夜+室温1h
二抗说明书推荐稀释度（自从更换2抗后1次也没做出过）：1：5000到1：20000 ；实际使用稀释度：1：5000/8000 ；二抗反应温度和时间：室温2小时
洗膜时间×次数：洗三次，10/15分钟均用过
显色（时间）/显影（压片时间）：用ECL 显色，显色及压片均5 min
结果描述:几乎是白板，没有出现目标条带，内参也看不到

1. 电泳、转膜肯定没有问题（a.丽春红染过有条带，考马染胶无蛋白条带；b.Marker仅胶上清晰，但转不到膜上？？？？；c.2周前还能做出结果）

2. 1抗较贵，师兄已经说我在喝抗体了，急
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dream2013[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然内参都有问题，那么建议先停止目的蛋白只作内参，直到内参稳定为止。如下：
1 一二抗不匹配这种低级错误先排除。
2 测试HRP和底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各100ul，加入0.5ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明二抗和底物尚好。
3 拿一小片灯光下曝光的片子显影定影以确保显影液正常。
4 定性信号过高/过低：做1次内参western，加了底物后立即到暗室看有无荧光。如3min内未看到荧光，那么压一张过夜的片子。或者采用同时压片2～3张，不同曝光时间，具体见1楼。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，如何解决非特异性条带的问题，对于这个看了您的帖子我还是不是很清楚，显影后我的非特异性条带出现的比较严重，看起来条带几乎都出现了，请问这是不是与封闭的不好有关？
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是啊，我的也是出现了问题啊，非特异性的问题比较严重，内参部分非特异性的多，但是目的的又还好，不知道为什么呢，难道是封闭的原因，希望哪位高手指点一下呢？还是内参出了问题？
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一次做Western，没敢上抗体，只做内参，但已经有问题了

目的蛋白名称：Actin；分子量：43kd
样本组织名称：小鼠晶状体、视网膜
样本提取：采用先买的RIPA和PMSF。一个星期前取材，第二天提蛋白，-70度保存。
样本浓度：晶体蛋白为80微克/微升；其余的视网膜蛋白为10-13微克/微升。
上样量：50微克，其中晶体蛋白用裂解液（含PMSF)稀释20倍，其余稀释4倍，加现成的5*loading buffer。总上样体积大约在15微升。
样本特殊情况：也因为样本量不多，我按照10微升分装，前天测浓度后，在冰上放了1个多小时，然后放到-20度，第二天跑胶）
一抗：Actin,Cell signal 第一次一个老师没做出来，然后要求公司换了抗体，这次是第一次用）
一抗质量评价：第一次一个老师没做出来，然后要求公司换了抗体，这次是第一次用
分离胶浓度：12% （其中AP，TMED，丙烯酰胺，TRis-HCl PH8.8 原装进口）分离胶过夜）
跑胶：80V-浓缩胶；120V-分离胶（手动换）
转膜方式：湿转 ；
转膜强度（恒流）×时间：60mA，150 min
封闭液名称：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：37度2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：1000; 使用稀释度:1：1000;
一抗反应温度和时间: 4度过夜，但早上发现一抗漏了，重新加一抗，37度1小时+室温摇床1小时
二抗说明书推荐稀释度：1：1000到1：3000 ；实际使用稀释度：1：2000；（进口了，买的时候进两千，别人用过，做出的条带很漂亮）
二抗反应温度和时间：37度1小时
洗膜时间×次数：洗三次，10分钟
显色（时间）/显影（压片时间）：用ECL 显色，无荧光，压片5分钟，自动显影
结果描述:内参条带很弱而且很淡
跑胶情况：用的是Bio-Rad电泳槽和电泳仪。本想预电泳，电压为10V，但总被提示No Load，没法跑胶。在浓缩胶的时候，纵向压缩还可以，但是横向扩散很严重，从胶片的创导情况可以看出。但到分离胶后，纵向扩散。
胶和膜的靠然情况：仍然显示串道，五个样本其中有一个样本大分子量部位很淡，但在小分子量的时候有浓聚。
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 小中大

我是用测浓度的剩余样本跑胶
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做WB，actin内参，100V转60min，5%BSA 4度封闭过夜，一抗天津津脉actin，1：200稀释，室温孵育1.5h，然后用TBST洗6次，每次15min，二抗天津津脉1：4000稀释，室温孵育1.5h，TBS洗4次，每次10min，用ECL（Perice）显影，压片1min，背景特高请高人指点谢谢！
还有一个问题，就是转完膜后用立春红染膜，什么也看不到，为什么？谢谢


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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-4-5 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做WB，actin内参，100V转60min，5%BSA 4度封闭过夜，一抗天津津脉actin，1：200稀释，室温孵育1.5h，然后用TBST洗6次，每次15min，二抗天津津脉1：4000稀释，室温孵育1.5h，TBS洗4次，每次10min，用ECL（Perice）显影，压片1min，背景特高请高人指点谢谢！
还有一个问题，就是转完膜后用立春红染膜，什么也看不到，为什么？谢谢
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