蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 57  5/6 ‹‹123456››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
41

发表于 2013-4-5 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家一般在裂解细胞时加多少细胞裂解液，６孔板，１２孔板？
顶部
kulee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
42

发表于 2013-4-5 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实有个最好的办法，就是买一台化学发光成像仪，可以动态捕捉累加发光信号，我们实验室就是这样的，国产的才12万就可以搞定，不用显影定影液了，也不用压片，获得一系列动态图片，从中选择最漂亮的一张。整个发光过程只需要不到10分钟。
顶部
雪山飞鹿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79771
精华 0
积分 153
帖子 85
信誉分 100
可用分 1131
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
43

发表于 2013-4-5 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚开始做western遇到了问题而看到这个帖子，却是两年前的发帖，不知道您是不是还会回顾这个帖子给我解答？
1.电泳电压应该如何确定？8V/cm & 10V/cm？正负极之间的距离又该如何测量？我们电泳仪的说明书不知道让谁给弄丢了……我用不同的电压跑胶，跑完胶需要的时间为1-2小时不等，考马斯亮兰染色发现跑胶两个小时的结果和一个小时的结果没太大的差别。是不是说明我可以用一个小时跑完？
2.我第一次显影的结果是“反影”以及“显影后膜上条带处变为黄色”，第二次做的时候，我把一抗稀释了2倍，二抗稀释了4倍，结果还是出现了“显影后膜上条带处变为黄色”的现象。另外，在无光暗室中，可见膜上印迹点的荧光，压片后底片上的荧光很弱，延长压片时间至30min，底片上无印记出现，但膜上印记处仍有微弱荧光可见。我应该继续稀释二抗吗？？？
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
44

发表于 2013-4-5 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，想请问你一个问题，我做的目的蛋白是34KD的，用半干转，稳流（35mA）院子里好多人说稳流可以转出高质量的膜，我想问下什么样的膜算高质量呢？胶上没蛋白条带是吗？
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
45

发表于 2013-4-5 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我昨天晚上试着用两张胶片同时曝光，8min后取出下面的胶片显影、定影，上面的胶片却一点都没感光，所以两张胶片同时放是不太合适的，不知道其他园友有这种情况吗
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
46

发表于 2013-4-5 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的泳道也被显出来了 为什么的啊？稀释了一抗 二抗 就做不出来了
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
47

发表于 2013-4-5 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主能不能帮我分析下我的片子的问题？谢谢cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=13681258&sty=1&tpg=1&age=0')
顶部
66小飞侠[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75376
精华 0
积分 466
帖子 651
信誉分 100
可用分 4008
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
48

发表于 2013-4-5 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我显影后发现胶片上出现了marker的条带，但是目的条带没有出来，整个胶片很干净，除了隐约有mark的条带什么都没有，不知为何？难道一抗都结合到maker上去了？
我的一抗是兔来源的多克隆抗体，cst的，希望楼主给予解答！
顶部
bling[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77268
精华 0
积分 383
帖子 486
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
49

发表于 2013-4-5 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分析的太好了，原来我做出来的一片漆黑叫“反影”，我以为二抗便宜，就1:2000在做，昏啊，强烈鄙视我自己。
顶部
TAT[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74236
精华 0
积分 507
帖子 694
信誉分 100
可用分 4298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
50

发表于 2013-4-5 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我过一段时间也要作western，不过我的蛋白质分子量很小，只有15KD，是不是很不容易做出结果啊？谢谢了
顶部
 57  5/6 ‹‹123456››