比较蛋白质组学

双向电泳时理想的样品制备方法的条件
1,在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。
2,避免溶解性低的蛋白质（如膜蛋白）在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。
3,防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。
4,排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。
5,获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。

样品的全息制备
   有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。在进行样品全息制备时必须考虑一切影响等电聚焦（IEF）和凝胶电泳的因素都有应考虑在内。方法可以从简单缓冲液溶解，到应用离液剂（chaotropic agent）、还原剂（reducing agent）、及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂的顺序提取（sequence extracting）及亚细胞器分级等。
  离液剂（chaotropic agent）:尿素是最常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5~8mol/L尿素联合使用。
  还原剂（reducing agent）:还原剂主要是用来断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有β-巯基乙醇、DTT和三丁基膦等。其中DTT使用比较广泛，在50mmol/L时能有效地还原大部分二硫键，但有些蛋白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度由于它的pKa有8左右，因而会影响到pH梯度。另外，DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。
  去污剂:去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂TritonX-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦，然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于0.3%时，对等电聚焦不会产生太大的影响。传统的非离子型去污剂，如Triton X-100和NP-40，以前用得较多，现多数以兼性离子去污剂CHAPS（3-[（3-cholamidopropyl）-Dimethylammonio]-1-Propane sulfonate）代替。CHAPS比其它去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在1%~2%。然而它在高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌