蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-4-10 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢这个版面，让我学到了很多东西。我现在的困惑是：以前用pET-29b的载体，蛋白表达量非常多，用Ni－His Tag纯化柱过柱后量也非常多很纯，但一复性后，蛋白跑电泳就没有带了，我需要融合蛋白作凝胶阻滞，现在柱子没有了，还有没有不用过柱得到融合蛋白的方法，用尿素是不是可以？但怎么用尿素变性复性啊？
另我还试过GST载体，也是可溶性很不好，也在包涵体里，急死我了，那位战友帮帮我。
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发表于 2013-4-10 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于上离子柱的PH值，我已经摸索了很多了，还是不理想。你们所讲的PH值是复性时的吗？我的等电点是5.6，复性时是8.5。我用的是稀释复性的方法。希望给予帮助
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发表于 2013-4-10 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yapuyapu 于 2013-4-10 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢这个版面，让我学到了很多东西。我现在的困惑是：以前用pET-29b的载体，蛋白表达量非常多，用Ni－His Tag纯化柱过柱后量也非常多很纯，但一复性后，蛋白跑电泳就没有带了，我需要融合蛋白作凝胶阻滞，现在柱子没有了，还有没有不 ...

上面我说过一次，想改变蛋白以包涵体形式存在不但要有一定的理论知识为基础，而且还需要很大的运气成分，不容易。我试了很长时间也没能改变目的蛋白的存在形式。

我能问一下你用的是什么方法复性的吗？如果用常用的透析复性的话出现多数都是会出现沉淀的，是因为透析液的PH值接近蛋白的等电点，从而导致蛋白不带电荷，也就没有了相互的排斥力，从而产生了蛋白沉淀。最常用的方法就是改变透析液的PH值了，我今天用PH9.5的透析液也透析成功了。

8M的尿素是可以得到可溶性的蛋白，但是如果没有纯化的话是很不纯的。为什么没有镍柱了呢？一个可重复使用的镍柱只需要400块，呵呵。。蛋白纯化的方法有很多种，比如说凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等等，但是用哪种方法都要花钱啊，呵呵。
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发表于 2013-4-10 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nn255 于 2013-4-10 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
关于上离子柱的PH值，我已经摸索了很多了，还是不理想。你们所讲的PH值是复性时的吗？我的等电点是5.6，复性时是8.5。我用的是稀释复性的方法。希望给予帮助 ...

稀释复性必须对pH, GSH与GSSG的比例与浓度，精氨酸浓度，样品量及复性温度等条件进行优化。现在普遍流行的稀释复性液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG。你上面问你没有加Nacl 和20 mM Tris-HCl对于稀释复性是正确的，无需改变。

不知道biosepq斑竹提到的PH是指的什么。我所说的PH是指平衡缓冲液和复性缓冲液还有你蛋白等电点之间的条件优化。应该注意所选择的PH 值应该使目的蛋白和树脂的亲和力达到最大,同时杂蛋白和树脂的亲和力最小,从而在洗脱时达到纯化的目的。真的不好意思，对于离子交换纯化我没有实践基础，所以只能给您指出一点从理论上来说的意见：

如果是阴离子介质，可以先取一毫升介质分别放入4个小试管里，再用pH为7，8，9，10的缓冲液分别平衡5次然后在每个试管中加入样品，样品的pH值要和相应试管的pH值对应。让样品充分和介质反应一段时间后，离心取上清，跑电泳。看看在不同pH条件下样品和介质的结合情况。阳离子介质的pH值可设为3, 4, 5, 6和前面讲的方法一样。还可以先跑一个凝胶柱，把不同的分子量的组分分开，然后根据前面所掌握的蛋白在不同pH条件下的带电情况，进行离子交换层析（仅供参考）。

离子交换chromatography 兄做的非常好，他是专业的，你可以去他那里问问，呵呵。链接如下：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1042756&sty=1&tpg=1&age=0')

还有，既然这种方法不理想为什么不换一种纯化方法试试呢？
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发表于 2013-4-10 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

复性成功与否，应该有特异性的方法。
总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。

你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。
那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高是binding不上的。
pH3上阳离子是不合适的。

试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。
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发表于 2013-4-10 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。
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发表于 2013-4-10 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 831226 于 2013-4-10 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。


并无文献上说明具体的比例，说说我的供你参考。

100ml大概能得到0.03－0.05g的包涵体（每次称重都特别不好称，可能是由于每次液体吸的不干净，或是由于天平的误差)。不管得到的是多少我都是加入1.5ml的溶解液（我用的是8M的尿素）后加入15ul的DTT，然后4度过夜，或是室温5小时，效果一直很好。就这样。

我觉得如果不是GST融合蛋白都可以用8M的尿素溶解，而且加多加少不会有很大影响，我们实验室的几个人表达的蛋白都是以包涵体的形式存在的，都是用我上述的方法，效果都一样。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-4-10 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！
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发表于 2013-4-10 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 wmp1234 于 2013-4-10 16:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！ ...

战友有几个问题没有说清楚：

你说上柱时出现结晶，是什么地方出现呢？是在柱内还是在EP管中。如果我没记错的话，6M的尿素的冰点好像是－11度，这样如果避免低温的话，应该不会出现结晶。

你的binding里面加的咪唑浓度是多少，binding buffer的咪唑浓度一定要比最低的洗涤buffer的浓度低。

还有一个就是战友出现了重大错误就是在Elution buffer中没有加入尿素。虽然说咪唑和蛋白竞争柱中的镍离子从而达到纯化的目的，但是我试过如果洗涤液中不加入尿素的话而仅仅用PBS是洗不下来的，具体为什么不能理解，猜测可能是由于蛋白不能溶于其他溶液中，所以即使脱离了镍离子也不能被洗涤流出，而是短暂的脱离后又重新结合了。

镍柱纯化要利用一个咪唑剃度来洗脱目的蛋白，而不是仅仅用一个浓度的洗涤液来纯化。低浓度的咪唑是洗不下来的或者说洗下的非常少（没有结合牢固的蛋白）。所以你要加大咪唑浓度，而且要做一个剃度，看一下在哪个浓度你的目的蛋白的洗脱量达到最大而杂蛋白的洗脱量相对最小。
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发表于 2013-4-10 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上柱时出现结晶,是样本上柱到柱内而不是EP内.我的6M尿素的binding buffer 是保存在4度冰箱中的,而且柱的平衡是用含6M尿素的bingding buffer时也未出现结晶.

我的binding里的咪唑浓度是30M,

还有就是我的HIS-IDA柱的树脂是不是不能再重复利用了,按照战友的说法,树脂里还含有我的蛋白,是不是要重新换过了?

以战友的经验,我做30M,50M,80M,100M这几个梯度可以吗?
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