蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
251
 

我是用亲和成析的方法纯化蛋白,如何让杂蛋白少些,是在Washing buffer
中的盐的浓度加大些,我现在Nacl的浓度是150mM,在加大到多少好呢?
顶部
qiangren789[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73754
精华 0
积分 333
帖子 365
信誉分 100
可用分 2651
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
252
 

请问:包含体变性后,是先复性后再纯化还是先纯化后再复性?那种方法好,区别在那里?透性时,透析液的ph值与透析袋内溶液的ph值是否要一致或接近?
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
253
 

看了您的关于父亲母亲的文章,很感动!
请问包涵体复性的问题,我通过8MUrea,5mMDTT溶解包涵体后,透析前蛋白浓度3mg/ml,利用您给出的透析体系透析24小时,没有活性,透析后的蛋白浓度是0.1mg/ml.透过电泳有与目的蛋白大小的条带,原来通过8MUrea溶解的杂带又重新沉淀,虽然条带与目的蛋白大小一致,但没有活性不能确定就是我的蛋白。通过稀释的方法也是同样的结果,只不过可溶的蛋白较透析的浓度低。
做了将近一个月复性,很困惑哦,请您指教!谢谢
顶部
IAM007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75217
精华 0
积分 464
帖子 608
信誉分 100
可用分 3861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
254
 
我的GST融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达, 我用6M 盐酸胍溶解包涵体后,上阳离子交换柱(我的目标蛋白用蛋白
软件预测等电点在9.2左右),所以我用了ph7.5的50mM 磷酸盐缓冲液作为start buffer, start buffer 里含有8M尿素, elution buffer
里也含8M尿素,还有1M NaCI, 但奇怪的是我的目标蛋白大部分随着 start buffer 给冲洗了下来(SDS-PAGE鉴定),很少挂到柱子上,
需注明的是我的盐酸胍溶解样是可以溶解在start buffer 里的, 并且在上柱前是用start buffer 稀释了5倍,并跳ph值到7.5.

小弟现在在做包涵体的纯化及复性! 想通过离子交换柱进行尿素浓度梯度复性,但必须得先让目标蛋白吸附到柱子填料上吧,
最近这个鬼复性把我给搞死了,迟迟拿不到我的目标蛋白。

望各位色谱高手给指点指点啊

还有希望做过蛋白复性的高人能多多交流交流!!!
顶部
newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
255
 
请教各位高手:
溶解在8M尿素中的包涵体用bradford法测浓度,尿素对最终结果影响大不大?
顶部
DDD[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73222
精华 1
积分 587
帖子 790
信誉分 102
可用分 4768
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
256
 

请问:我的包涵体用8M尿素溶解后,透析梯度复性,但是最后对PBS透析的时候出现大量沉淀,做SDS-PAGE的时候上清没条带,但是沉淀条带也很浅,跟对1M尿素透析沉淀比更浅了,应该更深才对呀,因为肉眼看沉淀更多了,请大家多多指教,实验进度很慢,挠头啊!!!从下数第二个条带是我的目的蛋白


查看积分策略说明
附件
2013-4-11 13:31
21880627.jpg (3.24 KB)
 
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
257
 
想问下版主你透析去除尿素,咪唑以及其它小分子蛋白质,怎么确定完全除去了呢?新手上路,还望多指导,谢谢!
顶部