小中大4、 液相色谱(LC)复性法:液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法,已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段,现有报道,疏水相互作用色谱(HIC)[23]、离子交换色谱(IEC)[24]、凝胶排阻色谱(SEC)[25]、亲和色谱(AFC)[26]已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比,液相色谱复性的优点是:在进样后可很快的除去变性剂;由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生,提高蛋白质复性的质量和活性回收率;在蛋白质复性的同时,可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行;便于回收变性剂,降低废水处理成本。4种色谱法,SEC的分离效果是LC中最差的,盐酸胍会在IEC柱上保留,与蛋白一起洗脱下来,AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵,HIC是其中较为理想的。变性蛋白在HIC上的复性机理为:当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后,由于变性剂在柱子上的作用力较弱,变性蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白质分离,随流动相一起流出色谱柱,又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量*,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子*,而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构,接着形成折叠中间体,随着流动相的不断变化,变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附,并在此过程中逐渐被复性,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质,并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质,且与变性剂瞬时分离,不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用,还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量,使水化的变性蛋白质瞬时失水,并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离,且HIC柱便宜、快速,故有很好的发展潜力。
5、 反胶束复性法[27]:由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性,运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内,由于这样可使蛋白质相互分离,减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用,通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂,可使变性蛋白质复性,但表面活性剂对蛋白质具有变性作用。
6、 双水相复性法[15]:Forciniti用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成。由于PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用,这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中,直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。
蛋白质知道如何折叠,但我们对蛋白质折叠和聚集的机制尚不十分清楚,每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径,因此对某种蛋白质的复性必须反复试验,利用折叠和聚集的知识建立相对优化、适合生产规模的方法。
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