蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在PET-HIS载体中表达的肽6KD在28度加IPTG0.3mM诱导
结果基本上都在超声沉淀中，由于我的肽中含有3对二硫键
而且用8Murea溶解不了，只能用6M盐酸胍来溶解，用梯度复性结果在2M到1.5M盐酸胍过程中会产生大量沉淀，复性困难，特向各位大虾请教
问题：1.为何难以复性？
2.由于需要大量纯化的蛋白复性的和变性条件的都要，有何好的纯化方法？快速大量的？
3.可否让此肽在溶解状态中表达些，需要改变何条件？
谢谢！
用于制备抗体，我想大量纯化，在变性条件下也性，包涵体如何直接挂柱？？？
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问1:复性中蛋白析出最大的可能是：蛋白浓度太高。可以适当稀释(一般为0.1-0.2mg/mL)，再进行复性。

问3：可以尝试更低的温度诱导，如16度。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能杂蛋白会影响蛋白的复性，对于你的蛋白，可以先用Urea洗涤沉淀，尽量去除杂蛋白，然后用盐算呱溶解，然后可以上Ni柱精纯，纯化后再复性可能比较好。
另外由于你的蛋白分子量比较小，可以用SOURCE RPC纯化，纯化后再复性。
另外，你的二硫键都正确么？如果二硫键不全正确，可以用C18进行分析，正确的二硫键和不正确的二硫键出峰时间是不一样的，可以用于检测复性成功与否。你的二硫键如果可能不正确的话，还是要加入氧化还原对可能会复性的好些。
另外，稀释复性也是比较好的方法。
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flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ukonptp 于 2013-4-10 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能杂蛋白会影响蛋白的复性，对于你的蛋白，可以先用Urea洗涤沉淀，尽量去除杂蛋白，然后用盐算呱溶解，然后可以上Ni柱精纯，纯化后再复性可能比较好。
另外由于你的蛋白分子量比较小，可以用SOURCE RPC纯化，纯化后再复性。
另外， ...

谢谢。但是变性条件下得NI 条件和buffer如何配置？
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发表于 2013-4-10 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #44 flyxx05 的帖子

条件除了在binding buffer 和elution buffer中都加入8M 盐酸呱外，其他的操作没有区别。
不过用盐酸呱跑电泳比较麻烦，还要处理样品去掉盐酸呱。
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发表于 2013-4-10 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

变性条件下纯化：一般是在binding buffer和elution buffer中加入8mol/L 脲，binding buffer中可以加入5mM 2-巯基乙醇，这样可以减少沉淀，但你的蛋白在8 mol/L尿中不容，因此可以改成6 mol/L盐酸胍
Ni注复性：binding buffer：6mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS + 5mM２-ME (pH7~9), refolding buffer: 1mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS (pH7~9), elution buffer:1mol/L 咪唑 + 1mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS (pH7~9), binding buffer和refolding buffer中可以加入低浓度的咪唑，视你的蛋白保留强弱而定。走梯度，bind to refolding, refolding to elution，
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flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是用6M盐酸胍溶解的？是不是以后的缓冲buffer及洗脱buffer都用盐酸胍，用urea代替可以吗？我们洗脱下来的蛋白如何除去盐酸胍，用梯度透析吗？
如果需要大量这么操作，你们能不能将具体操作步骤告诉我一下？?
谢谢!
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发表于 2013-4-10 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
脲可以代替，如何除去变性剂，用梯度透析或者SEC都可除去盐酸胍或脲。另外，如果你要求得到的蛋白溶液中不含变性剂的话，你可以直接采用Ni柱复性的方法，只是refolding buffer和binding buffer中不要加GuHCl
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tudou85[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是用6M盐酸胍溶解的？是不是以后的缓冲buffer及洗脱buffer都用盐酸胍，用urea代替可以吗？我们洗脱下来的蛋白如何除去盐酸胍，用梯度透析吗？
如果需要大量这么操作，你们能不能将具体操作步骤告诉我一下？?
谢谢!

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可以按你说的只用盐酸胍溶解样品,别的跑柱子的缓冲液用尿素,这样就没有盐酸胍问题,同时有利于提高柱子的载量,PM邮件给我,我可以发给你操作的方法.
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flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

脲可以代替，如何除去变性剂，用梯度透析或者SEC都可除去盐酸胍或脲。另外，如果你要求得到的蛋白溶液中不含变性剂的话，你可以直接采用Ni柱复性的方法，只是refolding buffer和binding buffer中不要加GuHCl
请问这个是如何具体操作的？
还有各位有没有用过电洗脱，想知道具体如何操作的，谢谢
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