【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴 - 经验共享

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以加少量的B-巯基乙醇，分解包涵体，释放出你的目的蛋白，然后再提纯，我上次坐试验也碰到同样情况，但是如果你表达的蛋白不是很多，也很难提纯。你表达的时间长吗？如果是时间长引起的，建议减少表达时间，但是如果表达量不足，你就不得不延长表达时间。

yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有时候,蛋白表达过程中形成包涵体你应高兴才是:
1,说明目的蛋白表达量比较高;
2,表达产物不会被细菌蛋白酶降解,这一点对原核表达短肽尤为重要;
3,表达产物有利于纯化,且纯度较高;
一点体会

remenb[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分子克隆第三版说可以将包涵体用Triton X－100溶解，
后续的纯化步骤与上清基本上没什么区别。
我觉得很疑惑，溶解后的蛋白在变性条件下能与柱子上的GS结合吗？
个人觉得GST与GS的结合是一种酶反应，
应该要求GST有活性才行啊，变性条件下可以吗？
谢谢指教！

bring[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

包涵体应该不可以过柱子纯化的，但是在实际的实验过程中我们发现有的是可以的，原因可能是：
部分蛋白是可溶的；
用Triton 100后，可以将聚集在一起和目的蛋白共纯化的其他蛋白质分散开，这样，部分可溶的蛋白就可以和珠子结合了。
强烈推荐阅读分子克隆第三版相关章节的参考文献。

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知你有没有<GST handbook>（园子里有）包涵体是不能与结合到GSTrapp柱子的，<GST handbook>上加入Triton X－100是助溶（非变性条件下的可溶部分可能已经正确折叠，有活性），此外还可加DTT，增加与GS的结合。我们曾按<GST handbook>的troubleshooting的建议（类似你所述的方法）处理过表达的包涵体蛋白，没有成功。

如果你表达的GST融合蛋白是包涵体，可以按分子克隆的方法洗涤包涵体，得到纯的包涵体后再复性纯化。
在目前情况下，可优化表达条件（如温度），以期获得可溶性表达。

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发表于 2013-4-10 12:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问GST handbook是什么东西,是买GSTrapp柱子商家的使用手册吗

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

GST handbook,是关于GST融合蛋白表达的操作手册,在本站的ftp上有下载,

但是你的分数是0分可能下载不了,至少要1分才得,再想想其他办法吧,

或者你可以通过google 搜索得到我以前也是这样下的

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）

超声时所用的频率以及时间是跟你的表达菌的种类以及你目的蛋白的性质密切相关的。比如说你的表达菌的承受能力比较强的话，你就可以适当加大超声频率以及超声时间，另外，比如说你的目的蛋白是以包涵体形式存在的话那么你就要注意你的超声力度了，因为很有可能对目的蛋白有很大的影响。一般实验室的超声仪探头的最大承受频率大概也就是400W，所以可以选用300w，超声10s，停止10s，或是选用400w，超声5s，停止5s。超声如果效果较好的话，整个样品应该是比较清亮的，但是并不是十分清亮，当然这跟你在湿菌体中加入pbs的量是有关系的，加多了，就清亮些，加少了，就浑浊些。还有就是超声效果如果好的话，样品不会出现像原来的那种教粘稠的情况，因为长链核酸全部被打断了。
当然为了减小超声的负担，可以在超声前加入溶菌酶，反复冻融等步骤。这也要根据宿主菌而确定。

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发表于 2013-4-10 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在 20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是 Pbs缓冲液，老是出现沉淀
谢谢 ...

复性问题是表达蛋白过程中的一个很棘手的问题，因为氨基酸组成的不同，造成蛋白不同的性质，同时也使复性变得困难。
包涵体蛋白复性方法大概有如下几种：
稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性，此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
鉴于战友的情况，我个人认为应该使用Tris缓冲液较好，因为目前普遍认为大多数蛋白复兴使用Tris缓冲液效果较好（这可是有文献可查的哦）。至于出现沉淀这一点是不用说的，再成功的复性也会出现沉淀，而且我觉得复性也可以看作是一个纯化的过程，我们期望看到沉淀，因为沉淀的不仅仅是我们的目的蛋白，还有一些杂蛋白，即使按比例沉淀，我们的目的蛋白还是越来越纯了，不是吗？而且这一点我认为战友没有必要担心，如果目的蛋白浓度过小的话，你可以在复性结束后浓缩一下以提高浓度。当然如果目的蛋白全部沉淀的话，就说明这种缓冲液不适合你的目的蛋白，就要改变复性方案了。
影响复性效率的因素就有很多了，比如蛋白质的复性浓度、pH和温度等等等等。

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需

Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。

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