蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】包涵体如何复性?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】包涵体如何复性?

mysmdbl[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77053
精华 0
积分 314
帖子 327
信誉分 100
可用分 2446
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
1
 

【求助】包涵体如何复性?


各位好:
请问包涵体如何复性?请教:包涵体的复性

我原核表达了一个蛋白,发现是以包涵体形式存在。用盐酸胍变性溶解镍柱纯化后。
上次我用0。5mol/L Tris, pH7.9;10%的蔗糖;1%的甘氨酸复性透析一天。发现该蛋白还是不溶的形式出现。各位遇到包涵体是如何复性的望能指点迷津,不盛感激。
顶部
vivian4123[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75243
精华 0
积分 417
帖子 494
信誉分 100
可用分 3331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2
 
包涵体的复性主要有两种方式:
1,稀释溶液,但是操作的液体量大,蛋白稀释
2,透析,超滤或电渗透析去除变性剂
其中透析很适合实验室应用,但是时间长。另外,如果蛋白质右两个以上的2硫键,很可能错误形成配对,应用还原剂。还有,复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
另外,你用多大体积的透析缓冲液?可能不够,要更换几次
你家了多少蛋白呀 ?蛋白量过大也会使复性困难。
你用的透析代是否是新的,处理过没有?新代有化学杂质!
最后,有些复性过程就是还有沉淀(透析方法的缺点)看看溶液中蛋白含量,说不定已经够用了~~
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3
 

根据你说的情况,我认为包涵体的复性还要注意以下几点:

1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施。
3.透析前后均要离心
4.透析不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索。

祝你好运!!!
顶部
小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
4
 

我一直用还原-氧化谷胱甘肽体系复性。稀释复性4度24小时
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
5
 

我来补充几句,但愿有用:
1)包含体要彻底洗涤干净,洗涤液中加入适量Triton-X100.
2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性
3)复性液的组成很有讲究,本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h
5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定(望有经验的战友能更详细地讲解)
顶部
orangecake[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77305
精华 0
积分 512
帖子 724
信誉分 100
可用分 4431
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
6
 

TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除,在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧,忘了。
我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步,改变培养条件,再洗涤包涵体,有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带,这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。
顶部
junjie05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79902
精华 0
积分 450
帖子 560
信誉分 100
可用分 3646
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
7
 

请问,如果采用稀释法复性,最后将蛋白浓缩可以吗?

透析法不是耗时长,易形成无活性蛋白质聚集体吗?
顶部
算盘阿星[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103469
精华 0
积分 154
帖子 67
信誉分 100
可用分 1051
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
8
 
这也是我最大的问题。有没有哪位同仁使用过安玛西亚公司的纯化柱并复性成功的,请发表一下高见。
顶部
算盘阿星[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103469
精华 0
积分 154
帖子 67
信誉分 100
可用分 1051
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
9
 
这也是我最大的问题。有没有哪位同仁使用过安玛西亚公司的纯化柱并复性成功的,请发表一下高见。
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
10
 

相关疾病:
头痛
我用的也是这个纯化系统,可正在摸索中
头痛啊
顶部