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一、ChIP实验步骤
第一天:
(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有9ml)
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起,共800ul。
7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。
(二)、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后,10,000g 4度离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验,其余保存于-80度。
300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul 5M NaCl (NaCl终浓度为0.2M),65度处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。
10、1h后,在4度静置10min沉淀,700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体,另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
(三)、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物,加入4ul 5M NaCl,65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天:
(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后,每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转2h。
13、4度静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4度颠转10min,4度静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。
洗涤溶液:a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul 10%SDS, 100ul 1M NaHCO3, 800ul ddH2O,共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。
混匀,65度解交联过夜。
第三天:
(一)、DNA样品的回收
17、解交联结束后,每管加入1ul RNaseA(MBI),37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris.HCl(PH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
(二)、PCR分析