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标题:【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）

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发表于 2013-4-16 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问下自己的ProteinA+G agarose用来做Chip实验，该怎么预处理，，salmon sperm DNA和BSA自己都有的，求详细步骤。

=====================================================

详细的步骤，可以查看millipore upstates的试剂盒说明。
鲑精DNA需要先超声破碎成一定长度。另外还需要叠氮钠之类的。
配好溶液后，与琼脂糖反复置换，把琼脂糖溶液置换掉即可。
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发表于 2013-4-16 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RIP以用甲醛是不是不可交联啊，如果我用甲醛把感兴趣的蛋白和其他蛋白交联到一起，那么拉出来的RNA岂不是很杂，不知道想得对不对，请指教。

====================================================

RIP可以用甲醛交联。
甲醛是会交联蛋白-蛋白。所以交联时间的长短对于ChIP很重要。
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发表于 2013-4-16 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主！ 我的问题是我的chip结果阴性对照也有阳性带！ 而且重复了好几次，都有阳性带，郁闷！！！

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这样的结果在ChIP里面是很正常的。
说到底，ChIP只不过是通过抗体，富集了和特定蛋白结合的DNA而已。仅仅是富集。
对于目标条带，如果实验组是对照组的好几倍，而管家基因的条带差不多，那么就是实验成功了。

当然，ChIP实验比较难，失败了也是很大概率的事情。
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发表于 2013-4-16 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有一个问题想请教：就是CHIP里DNA纯化那一步用纯化柱的话，第一个BUFFER加进去后会有很多沉淀产生，这沉淀是什么呢？是SDS吗？可以直接离心丢掉吗？急盼回复，非常感谢。

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是的。这个沉淀是SDS。
SDS沉淀会连带DNA一起沉淀。会对实验造成影响。
我的解决方法是：把洗脱液分成几份，加水稀释，这样SDS也被稀释了。加入Buffer之后，也不会有沉淀。最后将纯化产物合并到一起。
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发表于 2013-4-16 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
弱弱地提问一下：chip是只能做已知启动子与蛋白的结合吗？如果是转录因子与其他顺式元件结合的可以吗？后者的结合可能没有前者结合那么紧密，对实验的结果影响如何啊？如果不清楚启动子，后序的PCR该怎么做呢？急求解答啊，谢谢！

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转录因子与DNA的结合也是可以用ChIP检测的。
后续PCR检测时，引物的设计是个问题，一般是参考文献查询。实在找不到文献，那么就在最有可能的区段设计引物吧。
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发表于 2013-4-16 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了帖子获益良多啊！有些问题不是很清楚，还请高手指教啊：input对照的作用是什么？是不是所有的引物在input对照里都能P出条带？看帖子又说用抗体同源的血清做对照的，这个对照是不是阴性对照？用的时候加多少血清呢？

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input是用来调节起始的细胞量的，使得对照组和实验组的起始细胞量一致。
抗体同源的血清是用来做为抗体负对照的，这样的负对照比较严格。但其实，只需要用一个来源物种一致的无关抗体就可以了。或者买只有Fc片段的抗体。
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发表于 2013-4-16 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教楼主抽提DNA后，是否需要将DNA调平后再做QPCR？还是直接等PCR结束后用Input来调整，可调整后IgG组也有一定的百分率，虽然相对抗体组为低，十分困惑！另外我用IgG来做阴性对照，Background总是很高。谢谢楼主指教！

======================================================

用Input调平后，用Q-PCR检测。
IgG组比抗体组低就可以了，恭喜你。
如果要降低背景，那么在实验过程中，一些小细节再注意下就行了。
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发表于 2013-4-16 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想请问一下为什么不推荐用santa抗体呢，愿闻其详
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发表于 2013-4-16 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我接下来准备做动物组织的CHIP，不知楼主有没有这方面的经验，希望楼主不吝赐教，谢谢！！
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发表于 2013-4-16 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用Input调平后，用Q-PCR检测。
IgG组比抗体组低就可以了，恭喜你。
如果要降低背景，那么在实验过程中，一些小细节再注意下就行了。

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还以为没人理睬，幸亏今天上来看看。感谢LZ！还有些不明白的，LZ提到用Input调平是在做Q-PCR之前吗？根据Input的DNA含量来确定各组做Q-PCR的DNA含量？我现在各组DNA大约是2-10NG， 各组之间不是均等的，等Q-PCR做完后，再根据Input来调整IgG和抗体组，请LZ指教
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