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标题:【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)

superboy[使用道具]
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启动子区很长,一般选用文献上已经定位好的启动子区,有些文献甚至会把引物序列公布出来,已经定位好的启动子区一般不会超过200bp。如果你研究的启动子没有细化定位过,那就很麻烦了。

异丙醇加个四分之一嘛

input是用来衡量不同种类的细胞的细胞量的。比如两种细胞A和B,研究某转录因子在这两种细胞中与某一个启动子的结合情况。那么细胞A和B的起始量必须是一样的,这个起始量就用input来控制。相信你已经看了protocol了,在操作过程的某一阶段中,取出等量的样品做为input,衡量input中该启动子的量,算出一定的比例(就是细胞量的比例)。最后ChIP得到的得到的数据要除以这个input的比例,方才是相同细胞量下结合情况的差异。
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xueyouzhang[使用道具]
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我想问一下UPSTATE的Kit中,做后续IB研究beads加SDS loading buffer是煮10分钟好像,但很多protocol都强调至少煮30反交联,有没有人做过的来解释一下,谢谢!
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hyuu[使用道具]
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好帖子,最近准备做。请问斑竹,为什么你只作了抗体和未加抗体组,而没有作其他抗体的阳性对照。
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superboy[使用道具]
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IB研究?不好意思不是很清楚。不过那个beads是agarose材料的。
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superboy[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 xueyouzhang 于 2013-4-13 12:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问一下UPSTATE的Kit中,做后续IB研究beads加SDS loading buffer是煮10分钟好像,但很多protocol都强调至少煮30反交联,有没有人做过的来解释一下,谢谢!

抗体组是实验组,未加抗体组是阴性对照组。你可以用个组蛋白抗体之类做个正对照,是否真实需要正对照具体情况具体分析。
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superboy[使用道具]
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“我拿到了DNA,但是实验组和对照组的量不同,我在做PCR之前是否应该调平呀?还有为了降低背景我的把DNA的量在体系中控制在多少以下?”

ChIP最后得到的DNA的量,实验组和对照组肯定不同,做PCR之前当然需要调平,不然就没有可比性。调平的时候就是Input发挥作用的时候了,实验组和对照组的Input其实就代表了ChIP实验的起始样品量(或者说是细胞量,DNA总量)。以Input为模板,引物扩增,计算出不同样品之间Input量的倍数,然后按照这个倍数,将ChIP产物按比例稀释。就调平了。
不过还是建议你做Q-PCR,Q-PCR更精确些。

至于“还有为了降低背景我的把DNA的量在体系中控制在多少以下?”
这个是要摸索条件的。
不过有一点需要注意下:就是反应体系中样品量最少应为2微升。因为我们所用的最小量程的枪为2.5微升,而枪在取样的时候总有误差。取样越少,那么误差在取样总量中所占比例越大,误差也越大。
Good Luck with your experiments!
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831226[使用道具]
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以上谈的基本上都是从细胞开始做的,有没有从组织开始做chip的protocol呢?
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dongdongqiang[使用道具]
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请问楼主,用的是哪家的抗体?抗体浓度多大呢?1ml的体系,只加1ul的抗体做免疫沉淀,相当于抗体的稀释比为1:1000,这样可以吗?我准备用,cell signaling的,推荐的chip抗体稀释比是1:50,我就觉得一管抗体还不够我做一次预实验呢,非常困惑中,期待您的解答,谢谢!
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dongdongqiang[使用道具]
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还有就是我超声破碎时,出现了很奇怪的现象,就是大约在100bp处有一团,但弥散的带从5000到100bp都有,请问楼主这是什么状况呀?该如何改善呀?
还有如果我加入SDS Lysis Buffer,使得细胞终浓度为每200ul含4×106个细胞。这样细胞数可以更多一些,这样可以吗?

初次做chip,问题比较多,现在正焦头烂额中,期待得到高手的指点!
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dongdongqiang[使用道具]
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“将2管混在一起,共800ul。超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。”
请问楼主,超声时,用的是800ul体系?为啥要准备这么大的体系?还有vcx指最大功率,就是楼主实际用的功率为750*25%=187?

不好意思一下子提了这么多问题,从您的总结里我学了不少,但这些细节问题能够使我少走很多弯路,我提问的时候没有总结好,辛苦楼主了,希望每个问题都能得到解答。万分感谢。
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