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标题:【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）

superboy[使用道具]
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发表于 2013-4-16 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"请问楼主，用的是哪家的抗体？抗体浓度多大呢？1ml的体系，只加1ul的抗体做免疫沉淀，相当于抗体的稀释比为1：1000，这样可以吗？我准备用，cell signaling的，推荐的chip抗体稀释比是1：50，我就觉得一管抗体还不够我做一次预实验呢，非常困惑中，期待您的解答，谢谢！ "

我用的是Sigma的抗体。加入抗体的量不是用体积来衡量的，而是用质量来衡量。我的抗体是2mg/ml。我加1ul就是2ug的量。

“还有就是我超声破碎时，出现了很奇怪的现象，就是大约在100bp处有一团，但弥散的带从5000到100bp 都有，请问楼主这是什么状况呀？该如何改善呀？
还有如果我加入SDS Lysis Buffer，使得细胞终浓度为每200ul含4×106个细胞。这样细胞数可以更多一些，这样可以吗？”

100bp处的一团是RNA。
提高细胞浓度，调整一下实验条件当然是可以的啊。

““将2管混在一起，共800ul。超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。”
请问楼主，超声时，用的是800ul体系？为啥要准备这么大的体系？还有vcx指最大功率，就是楼主实际用的功率为750*25%=187？”

因为收集细胞时要配平，所以我用了2管。然后混在一起是800ul。
因为我用的超声破碎仪是探针式的，如果体积太小，探针插入太浅就不好超声。所以我在1.5ml的EP管里用800ul的体系超声。如果你用的是Bioruptor之类的水浴式超声仪，就不用考虑体系大小的问题了。
vcx750是我的超声仪的型号。实际功率的话，我也不是很清楚。每个超声仪，都需要摸下条件。
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发表于 2013-4-16 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问大家Novus Biologicals 公司的抗体怎么样啊？
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superboy[使用道具]
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发表于 2013-4-16 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1 我定了试剂盒，但是试剂都比较少，我想自己配些试剂。在丁香园上看了您的贴子，里面有相关的配方。但是我搞不清楚CHIP dilution buffer 和 elution buffer 有什么区别。上面只有前者的配方，没有后者的。
2 超声后解交联 跑出来的竟然是条带，大概是700左右 看别人的图都是弥散的啊 不知道我做的是不是有什么问题 这样可以拿来做实验了吗
3 超声后的上清液冻于-80后 ，反复解冻上3次用于后面的实验可以吗
4 那个磁珠在免疫沉淀后可不可以离心的， 洗时可以用枪吹成悬浮液吧？
5 解交联时放水浴锅（62c）里静置过夜可以吗 说明书上说要rotate，我们这没有这样的装置，除非就是摇菌的摇床

answer：
1. CHIP dilution buffer是稀释超声破碎后的产物的； elution buffer 是从Protein A-argose上洗脱目的片段的，成分在protocol后面有，是碳酸氢钠+SDS。
2. 超声后解交联，得到700bp的单一条带？这是不可能的事情。。。。
或者你上个图给我看看。
3. 反复冻融会导致蛋白变性。有2个影响：一是蛋白变性，抗体识别不了目的蛋白；二是蛋白变性，凝聚沉淀。。。。显然后面的影响很恐怖。所以，尽量不要冻融吧。ChIP本来就不好做，何必再加上那些影响结果的过程。
4. 可以离心，但是要低转速，我的经验是700转就够了。悬浮液你还是上下翻EP管吧，用枪吹太激烈！
5. 过夜可以。但是要防止液体挥发，要用封口膜。。解交联可以静置的，我也是静置的。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2013-4-16 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面的图是我超声解交联后的情况 ，marker分别是2000,1000,750，500,250


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2013-4-16 12:35
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发表于 2013-4-16 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用上面这个超声条件做后续实验，PCR结果显示加IgG的那组也扩了出来。
后来我把超声的功率加大些，超声后解交联的图如下。很是疑惑。


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2013-4-16 12:35
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发表于 2013-4-16 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一张图750bp处弯弯的东西是样品里SDS含量过高引起的。

第一张图，其实超声的还可以，虽然主要在1000bp--2000bp之间，但总算有个主带。

第二张图，看不懂，加大了功率反而片段更大。

超声是比较麻烦的事情，影响超声片段大小的因素也很多，比如交联的程度。

还是多看看已发表的文章里，别人做ChIP的条件吧。
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发表于 2013-4-16 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主，在抗体孵育及免疫复合物沉淀的步骤中，常常要在4度颠转，因为实验室条件所限，我可否将EP管平躺放在冰盒中，然后将冰盒放在侧摆摇床 摇呢？这样会对结合有什么影响吗？
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发表于 2013-4-16 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2013-4-16 12:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主，在抗体孵育及免疫复合物沉淀的步骤中，常常要在4度颠转，因为实验室条件所限，我可否将EP管平躺放在冰盒中，然后将冰盒放在侧摆摇床 摇呢？这样会对结合有什么影响吗？ ...

肯定不稳定。

建议你买一个颠转仪，国产的就行，很便宜的，估计也就几百块。
然后把颠转仪放在4度冰箱里做实验。
这样温度，转速相对稳定些。
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finger[使用道具]
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发表于 2013-4-16 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主的分享。
想请教一下，您说的样品中SDS样品比较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，可能会在最终样品中混入SDS。可以加异丙醇，请问在哪一步中加，浓度大概是多少。是否适用于所有kit.我们用的是quigen 的PCR purification kit. 不知道合用不。
还有请问如何确定自己用的试剂盒是否需要加异丙醇?
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finger[使用道具]
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发表于 2013-4-16 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有您说您用的胶回收试剂盒，请问这个和pcr的试剂盒有什么区别不。是不是把第一个buffer直接加在最后的溶解液里。 我们这里有QUIGEN的gel extraction kit.不知道是不是一样合用。
我看了一下我们这里有3种试剂盒，都是QUIGEN的。
1。QIAquick PCR purification kit. 这里面的第一个PBIbuffer里面含有异丙醇(这个我自己是不是就不用加iso了)（Isopropanol）
2.QIAquick gel extraction kit.这个kit和上面的kit几乎一样只是第一个buffer不一样，我看了一下说明书，说如果直接从溶液中提而不溶gel的话，自己加点iso就可以了。
2。QIAEXII 可以溶解gel也可以直接提DNA,但是这个kit不用过滤柱，似乎提的比较不纯。但是它没提加iso的事情。
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