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标题:【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

主要是单点和多点性质相近而难以分离，这时候就要求对离子交换的盐离子梯度进行调整。B蛋白的修饰率可以很高，但多点修饰也多，所以我必须选择单点修饰最多的条件，因为B蛋白自产，所以不需要考虑太多成本
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2013-4-18 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？
在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。
我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵
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vcve[使用道具]
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发表于 2013-4-18 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问你几点
1 我想问一下你们的PEG是哪个公司的
2 为什么两个蛋白都是用20000的PEG修饰?(A蛋白用20000的还勉强,但B蛋白就不是很理想哦)
3 我看你的B蛋白的第5条带，就算是单个的PEG修饰的，那也未必就都是在蛋白的一个位点修饰的啊，你这个是怎么处置的？？？？？？？
4 你 电泳是用的什么胶？？？（效果还不错，PEG的影响不大，与普通的SDS-PAGE有什么改进的吗？）
5 你们最后的蛋白是用什么方法定蛋白浓度的??
6 如果你们用的是BCA /LOWRY 、、的话PEG有没有影响测定？？

呵呵 在说几点看法：
A蛋白做的修饰和分离效果都比较好，就是不知道最后有没有达到你要蛋白改变的目的，我建议你要是用个30000的双连的就会比较好。
要说B蛋白用的PEG就更小了（但单点修饰率还是比较高），最后改变的效果就更不明显了，要是用个40000的双链的就最好了，还有那后面两个峰的分离度不够高，这样以后用于大生产的话上样量就会很小，会加大很多生产成本，我建议你后面用阶梯剃度洗的话分离效果可能会好点，这样也比较好扩大生产。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的问题非常好
1：以前用得都是Nektar的，现在国产的也有了，效果也还可以，国内的厂家你可以在DXY查查
2：这两个蛋白都用过很多修饰剂做得，SPA5000，NHS10000 SPA20000等，发现SPA20000反应活性较高就采用SPA20000做得
3：单点修饰并不是同一个点修饰，单点在不同的点也有可能，但通常蛋白上总有一个氨基活性是最高的，修饰的可能性也最大，如果你要确定那个点进行了修饰，可能要对修饰蛋白进行酶解后分析了
4：常规胶，200V到底，也有电泳不好看的，呵呵。上面是纯化后的，PEG的浓度较低，照片也好看些，B蛋白那张图片有个修饰混合物，里面有很多未修饰PEG，就不是很好，后面我会贴出很多难看的，PEG确实会影响电泳结果的
5：Lowry方法测得，与OD280结果做过对照，差不多
6：你可以在BAC里看看PEG的影响，我们在Lowry里没有发现
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实不一定要PEG完全包住，这需要多者之间找到平衡点，PEG修饰后，蛋白活性肯定下降，但在血浆中保留性，稳定性，时效性有所上升，若有可能需要多加比较，从而找到平衡点
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？
在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。
我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵

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IgG的纯化我也做过一点，但印象不是很深刻。我记得有两个硫酸铵浓度的，开始是去除血清白蛋白，然后是沉淀IgG，我回去查查以前的记录，晚上贴出来
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

A蛋白多种修饰剂反应


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fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也希望更多的战友一起来讨论

1、PEG试剂我倒是国产和进口的都用过，做过对照，国产的有凯正和健凯的，都要比进口的差点，不知道你用哪家的。
2、我用过LOWRY测过，但有很多的絮状沉淀，用BCA到是没有，但就不知道准不准。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况

可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈
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fsdd817[使用道具]
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 小中大
A蛋白多种修饰剂反应

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呵呵，从这张图上看10000的修饰效果更好啊，但 可能后面的药效不是很理想吧，是不是这样啊riboenzyme??
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