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标题:【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-18 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DEAE纯化PEG修饰A图谱，cpubio战友，你的图谱是不是和这张有点像


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2013-4-18 12:31
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发表于 2013-4-18 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的结果是有点像上面的DEAE,多修饰和单修饰没有分开的趋势.成一个大峰洗下来,前面的多修饰多一些,后面的单修饰占绝大部分.

您的CM跑梯度时虽然没有完全分开,但至少有个分开的趋势,且趋势很明显,单修饰和多修饰成两个峰.我也用过CM,一个大峰就下来了,没有任何分开的趋势.更严重的是,有时蛋白会沉在柱子上,提高盐浓度也洗不下来.

您那张CM未优化前的图谱是修饰后的产物初分吗?应该不是碘染色吧?不然穿透峰不会没有条带的.从图上看您的修饰率的确很高,未修饰的蛋白只是很少的一部分.但多修饰的比重占的有些大.

不知道下面的纯化该怎么做,还望多多指教,谢谢!
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发表于 2013-4-18 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是初分，优化后的CM图前面我也贴出来了，蛋白常规染色呀，穿透峰里应该是未修饰的PEG了。你的蛋白怎么会沉淀到介质上？
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发表于 2013-4-18 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

猜测沉在上面的,因为高盐洗不下来.

CM填料前两次用还行,至少能洗下蛋白,第三次在同样盐浓度情况下电导上不去,蛋白洗不下来.以NaOH洗可洗下蛋白,填料处理后就没再用了.

据说处分修饰后蛋白对填料损伤很大,riboenzyme老师遇到这样的情况了吗?比如载样量和分辨率下降等.

我的蛋白在酸性条件下不是很稳定,活力损失不大,但可能形成聚集体.Q和DEAE效果不好,换阳柱也是迫不得己啊.
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发表于 2013-4-18 12:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，A蛋白都已经开始生产了，没碰到PEG修饰产物对层析介质有很大影响，小试时，装100ml介质，可以重复用很久，大概有十几二十次吧，中间做过CIP和SIP

在酸性条件不稳定那就比较麻烦，你蛋白pI大概多少？
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发表于 2013-4-18 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白PI是5.8,在试用CM时采用的是pH4.5 第一次是检验该条件下能否挂柱及洗脱,结果尚可;接下来跑梯度,也正常,只是蛋白一个很锐的峰就下来了.

上CM的样品已初步纯化过,未反应的PEG和蛋白早已去除,只是想把单修饰和多修饰分开.结果不理想.

其实我一直有个想法,在使用大分子量PEG时,由于PEG的柔性结构将蛋白表面电荷掩盖的很厉害,个别多修饰的异构体和单修饰的异构体在离子交换柱色谱行为上的差异并不大. 所以,归根到底一句话, 这东西分不开.呵呵

但这话是万万不能跟老板讲的,我只能接着试下去,希望能出一个好的结果
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发表于 2013-4-18 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的是什么修饰剂？哪个公司的？

你用什么方法初步去除未反应的PEG和蛋白的，我个人怀疑可能是第一步和第二步衔接上的问题，你能多贴些图片看看么。

单点修饰和多点修饰在电荷屏蔽上肯定是有差别的，我这里没有多点产物的等电聚焦图片。我把我的方法说一下：PEG修饰后，用10倍体积的上样缓冲液稀释，上样，可以参照A蛋白的方法进行
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发表于 2013-4-18 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.
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发表于 2013-4-18 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是初分，优化后的CM图前面我也贴出来了，蛋白常规染色呀，穿透峰里应该是未修饰的PEG了。你的蛋白怎么会沉淀到介质上？

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riboenzymeEG 在280nm下有吸收值??
我试过了,银染的效果还没有R250的效果好

我想如果他的蛋白是沉淀到介质上有可能是蛋白浓度高了,或者温差大了的原因. 这样可以先稀释上样试试,应该会好点
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发表于 2013-4-18 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.

我是南京的,呵呵,还请riboenzyme老师多多指教.

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你先用Q柱，得到单点和多点修饰产物，然后调pH，接着上CM，你测过上CM前的电导么？可能上CM时电导太高了，另外你这样先Q后CM也比较麻烦，建议直接上CM，开始梯度慢些，你的蛋白可能和我的A蛋白差不多，应该没问题，我大概会在26或27到南京，有机会聊
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