蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 188  6/19 |‹‹‹45678910111213›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化

韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
51

发表于 2013-4-18 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
riboenzymeEG 在280nm下有吸收值??

我试过了,银染的效果还没有R250的效果好

我想如果他的蛋白是沉淀到介质上有可能是蛋白浓度高了,或者温差大了的原因. 这样可以先稀释上样试试,应该会好点

============================================================================================================

PEG在280是有吸收峰的，mPEG-SPA20000过Sephacryl S-200凝胶过滤层析后有两个峰，第一个是PEG的，后面一个电泳什么都没有

染色我们一直用CBB染的，PEG用过碘染，CBB染色是足够了的

我觉得他上样浓度太高，从而会结合到介质上的，我们都是稀释十倍左右上样


查看积分策略说明
附件
2013-4-18 12:36
30067031.jpg (19.07 KB)
 
顶部
fsdd817[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78590
精华 1
积分 590
帖子 795
信誉分 102
可用分 4841
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态 离线
52

发表于 2013-4-18 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PEG在280是有吸收峰的，mPEG-SPA20000过Sephacryl S-200凝胶过滤层析后有两个峰，第一个是PEG的，后面一个电泳什么都没有

不会吧!!!!
PEG在280nm有吸收峰???
我还真没主意到这个,我记的是没有的啊!!!
他怎么会有吸收峰呢?? 没有肽键啊!!!!
而且我还全波长扫描过啊!!!

你怎么检测第一个峰是PEG的??
CBB染料是什么??
顶部
韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
53

发表于 2013-4-18 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题也困惑我很久，但Superdex75 和Sephacryl S200 都是一样的结果，我也作了PEG的全波长扫描，在280确实没有特征吸收峰，而在199nm和258nm出现峰，多讨论

CBB是考马斯亮蓝，电泳分析的第一个峰有PEG

PEG染色方法可以参考：
Kurfürst M. M. Detection and molecular weight determination of polyethylene glycol-modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Anal. Biochem. 1992, 200(2): 244–248


查看积分策略说明
附件
2013-4-18 12:37
33579440.jpg (12.44 KB)
 
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
54

发表于 2013-4-18 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知riboenzyme战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。
顶部
速冻虾米[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72227
精华 0
积分 109
帖子 18
信誉分 100
可用分 771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
55

发表于 2013-4-18 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你写的PEG的修饰反应中好像漏掉了一个很重要的因素：蛋白质浓度。

尤其是和NHS基团反应的时候，不同的蛋白浓度，产率有成倍的变化呢

这是影响修饰反应产率的最主要因素。

至于PEG修饰产物的纯化，个人认为最关键的因素有两个，PEG分子量，

和离子交换填料的载样量，对多修饰和单修饰分离有很大影响。
顶部
速冻虾米[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72227
精华 0
积分 109
帖子 18
信誉分 100
可用分 771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
56

发表于 2013-4-18 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

纯的PEG在280nm是没有吸收的，活化后的NHS基团在280有强吸收，如果是
PEG-ADL就没有吸收了，和蛋白质反应后，置换下来的NHS在分子筛的全保留体积内出峰，紫外有强吸收，但电泳检测没有东西。
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
57

发表于 2013-4-18 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当采用琥珀酰亚胺活化修饰剂时，N－羟基琥珀酰亚胺会在凝胶色谱小分子位置出峰，由于NHS在碱性条件下最大吸收在260nm左右，我们修饰剂活性就是采用UV法测定端基官能团活性的，所以280nm也有吸收
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
58

发表于 2013-4-18 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也希望更多的战友一起来讨论

1、PEG试剂我倒是国产和进口的都用过，做过对照，国产的有凯正和健凯的，都要比进口的差点，不知道你用哪家的。
2、我用过LOWRY测过，但有很多的絮状沉淀，用BCA到是没有，但就不知道准不准。

=========================================================================================

您好！不知您用的凯正修饰剂哪个方面觉得比进口的差？希望看到您的宝贵意见，我们会继续提高PEG修饰剂质量
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
59

发表于 2013-4-18 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知riboenzyme战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。

=============================================

你的猜想非常正确，游离的PEG的确穿透，280是NHS
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
60

发表于 2013-4-18 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题也困惑我很久，但Superdex75 和Sephacryl S200 都是一样的结果，我也作了PEG的全波长扫描，在280确实没有特征吸收峰，而在199nm和258nm出现峰，多讨论

CBB是考马斯亮蓝，电泳分析的第一个峰有PEG

PEG染色方法可以参考：
Kurfürst M. M. Detection and molecular weight determination of polyethylene glycol-modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Anal. Biochem. 1992, 200(2): 244–248

===============================================================================================================

不知您的uv谱是PEG还是PEG修饰剂？如果NHS修饰剂，溶解到buffer或水中修饰剂会水解（mPEG－SC，mPEG－SPA等水解时间不同，但是pH7左右半衰期也就20分钟左右），释放N羟基琥珀酰亚胺，碱性中最大吸收260nm左右
顶部
 188  6/19 |‹‹‹45678910111213›››|