蛋白质与蛋白组学

PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.

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是否用用我们凯正修饰剂啊？效果不错的。^_^是否有些自卖自夸

这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知韩梅梅战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。

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用分子筛做PEG修饰产物纯化有一定难度哈，因为PEG在流动过程中并不是以圆形存在，而是线条形的，兄弟要有心理准备哈，另外一点你用分子筛做纯化，以后放大也是问题

对于PEG的吸收峰，我是每段都染色的呀

你写的PEG的修饰反应中好像漏掉了一个很重要的因素：蛋白质浓度。

尤其是和NHS基团反应的时候，不同的蛋白浓度，产率有成倍的变化呢

这是影响修饰反应产率的最主要因素。

至于PEG修饰产物的纯化，个人认为最关键的因素有两个，PEG分子量，

和离子交换填料的载样量，对多修饰和单修饰分离有很大影响。

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蛋白质浓度是比较重要，蛋白量与PEG量应有最佳摩尔比

对于PEG修饰产物的纯化，能否更加详细探讨些

不知道你用的是什么修饰剂，修饰氨基很难做到定点修饰，前面我做的A蛋白的单点修饰也很难说是同一个氨基修饰的。对于您说的单修饰的色谱行为和多修饰很接近，这点很难说。不知道你上离子柱后这些多点单点修饰产物是不是都结合上了，梯度洗脱的情况是怎么样的，理论上来说，单点和多点修饰净电荷差别还是有一些的，我是改变洗脱条件而分离单点的。能把你的FPLC图和电泳图贴出来了，私下交流也可以

另外提醒一点：你修饰的pH值是多少？上样缓冲液的pH呢？一般修饰pH和上样缓冲液的pH是不一样的，如果你修饰混合物直接上柱肯定不行，这时候需要用上样缓冲液稀释修饰混合物，然后上样

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修饰NH2如果想选择修饰N端，可以用醛基修饰剂，如果想定点修饰lys的氨基，目前还没有这种特异修饰剂，只能靠调整pH达到修饰不同lys目的

不知您的uv谱是PEG还是PEG修饰剂？如果NHS修饰剂，溶解到buffer或水中修饰剂会水解（mPEG－SC，mPEG－SPA等水解时间不同，但是pH7左右半衰期也就20分钟左右），释放N羟基琥珀酰亚胺，碱性中最大吸收260nm左右

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还是制备PEG修饰剂的大牛呀？留个号，我现在这块做的比较少，但还有朋友在做这个，现在都是用国产的了

还是制备PEG修饰剂的大牛呀？留个号，我现在这块做的比较少，但还有朋友在做这个，现在都是用国产的了

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你好！我是北京凯正生物研发负责人，主要从事PEG修饰剂研究开发，希望你的朋友用的是我们修饰剂。

这一篇主要是讲PEG修饰条件
影响PEG修饰蛋白的反应条件一般有修饰剂用量、反应pH值、反应时间、反应温度等，某些种类的PEG需要加入其它试剂（如mPEG-ALD需加入硼氢氰化钠）时，也应考虑所加试剂的反应条件。
修饰剂用量：PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点。
就应pH值：PEG衍生物在不同的pH值条件下反应活性和修饰位点有明显差异，亲电性的琥珀酰亚胺在碱性环境下反应活性较高，主要与赖氨酸残基的E氨基反应，而在酸性环境下反应活性较低，主要与组氨酸的咪唑基反应。虽然先灵葆雅公司采用pH6.5的反应条件制备PEG修饰的干扰素PEG Intron A，但从修饰效率考虑，大多数亲电性PEG衍生物采用碱性条件反应。
反应时间：不同的PEG衍生物和不同的蛋白最佳反应时间各不相同
反应温度：一般为保留蛋白活性多采用低温条件。

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不过千万不要把你的NHS活化修饰剂溶解在你的高pHbuffer中，否则你可能得到依然是你未修饰蛋白，因为修饰剂已完全水解。如果你需要溶解PEG修饰剂的话，要溶解在酸性溶液中比如1mM HCl中，然后加入到蛋白溶液中