蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 115  10/12 |‹‹‹3456789101112››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会

ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
91

发表于 2013-4-20 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

860 bp....不是3的倍数呢，呵呵，笔误吧

200多个氨基酸里有14个是稀有密码子编码的，建议换菌株。特别是N端如果有较多的稀有密码子很可能影响表达。

关于毒性蛋白的程度，可以通过与正常平板来比较。毒性很强的是根本就不长，毒性较小的可以长的，但菌落很少/小。

个人意见。供您参考。
顶部
Ao7[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76545
精华 1
积分 647
帖子 790
信誉分 102
可用分 4976
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
92

发表于 2013-4-20 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，是861Bp,当时写错了，谢谢版主指点。我用GST标签的pGEX-4T-1-OPN载体诱导能够少量表达，His的换了菌株还是不表达
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
93

发表于 2013-4-20 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不同诱导条件，培养基，菌株，载体。。。

我现在同样存在这样的困惑

实在不行再换表达系统，是真核蛋白吗？
顶部
Ao7[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76545
精华 1
积分 647
帖子 790
信誉分 102
可用分 4976
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
94

发表于 2013-4-20 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是真核的，我想用原核表达系统表达蛋白，最后决定就用GST标签融合表达，不用His标签了，多谢版主一直以来的帮助，以后有问题再请教
顶部
INK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73382
精华 0
积分 348
帖子 375
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
95

发表于 2013-4-20 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚开始做原核蛋白表达，提一个菜问题：离心收了细菌后，用sonication buffer 把沉淀resuspend起来吗？sonication buffer 的pH对目的蛋白会不会有很大影响？

谢谢各位。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
96

发表于 2013-4-20 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sonication 用的buffer，其主要性质应该与后来的working buffer相似。pH的选择，应该避免选择pI附近。
顶部
987789[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
97

发表于 2013-4-20 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚开始做蛋白质的原核表达,整个编码框编码一个282aa的蛋白,我利用的表达载体是pET32,表达菌株为Rosetta(DE3)plys.
转化产物在涂布IPTG的平板上完全没有长菌落,而没有加IPTG的则生长很正常!
请问接下来应该有什么可以改进的,我表达蛋白是为了做纯化,一方面去做抗体,另一方面打算做一些互作方面的研究的!
新手上路,请多多指教!
顶部
00无名指00[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76070
精华 0
积分 493
帖子 666
信誉分 100
可用分 4151
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
98

发表于 2013-4-20 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果蛋白毒性比较大，推荐试试C41和C43或者它们的pLys。

cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WK7-45MG2WN-8S&_user=10&_coverDate=07%2F19%2F1996&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=f337c04ef0aa11ed9f72e5d9541b6425')

Over-production of Proteins inEscherichia coli: Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels

Bruno Miroux and John E. Walkerf1
The Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, CB2 2QH, UK
Received 14 February 1996; revised 27 April 1996; accepted 6 May 1996. Available online 19 April 2002.

这个通讯作者是1997年获得诺贝尔奖的老大，呵呵
顶部
00无名指00[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76070
精华 0
积分 493
帖子 666
信誉分 100
可用分 4151
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
99

发表于 2013-4-20 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个基因预测为一个转录因子.
我做过瞬时表达的,定位在细胞核内.应该和跨膜蛋白没有关系吧!
顶部
qianqin1977[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75849
精华 0
积分 370
帖子 460
信誉分 100
可用分 3076
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
100

发表于 2013-4-20 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这两个菌株不一定只针对跨膜蛋白.
顶部
 115  10/12 |‹‹‹3456789101112››