蛋白质与蛋白组学

关于前面的问题，

1. 我用的是DYT培养基，比LB中的tryptone含量高一倍。
2. BL21 Star DE3是一种优化的表达菌株，invitrogen网站上有一张图片，用该菌株做表达，产量要高于未突变的DE3，因为前者是某（些）蛋白降解酶的突变菌株。
3. T7 promoter 具有很强的可诱导性。在表达毒性蛋白的时候常用到glucose或者pLysE 菌株。前者抑制蛋白的本底表达；后者能产生一种酶使得在T7 promoter控制下的基因表达得到抑制。这些都是因为培养基能诱导一些本底表达。

所以，您用的是什么菌株呢？表达量跟菌株，外源片段，加IPTG的时间等等都有关系。从图上您可以看到，我这个蛋白的表达是非常高的。除了加入的lysozyme （14k 左右的那条带），目的蛋白在总蛋白中的量恐怕要达到80％了。所以微量的lactose很有可能诱导出较多的蛋白。

关于漏样的问题。胶上有说明，18 wells，30 ul。我都是点10 ul样。另外，同样的操作，在第三张胶图中看不到漏样的现象。(可以比较positive control旁边的带）。

Anyway，我的这个结论缺乏直接的证据。所以我用的描述是”培养基确实很可能存在lactose，而且应该是造成阴性对照表达的原因“。

要证明这个问题，可以用不含tryptone的培养基，比如Minimal培养基和DYT做个对比。这样也能说明问题。也许等下次做蛋白表达的时候会考虑做一个，到时候再把结果贴上来

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谢谢！
在诱导中，乳糖会被不断的降解，这也是我判断培养基中微量的乳糖不会影响诱导的原因。你已经表达出来了，这个问题就不值得深究了。

祝你试验顺利

谢谢！
在诱导中，乳糖会被不断的降解，这也是我判断培养基中微量的乳糖不会影响诱导的原因。

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这就是为什么用IPTG而不用Lactose的缘故。谢谢您指出这一点。

昨天看到一个autoinduction的培养基配方，

TB培养基＋1 ％Glycerol，不加IPTG。

我的理解是Tryptone诱导表达，不知道对不对？请大家指教。

ps: TB reciepe (Without glycerol): for 1 L

12 g Bacto-tryptone
24 g yeast extract
2.31 g KH2PO4
12.54 g K2HPO4

请问一下
你的阴性对照（未诱导？空载体？没有转化的菌？）也有条带表达，你怀疑是乳糖诱导的，
那你为什么不用空载体或者没有转化任何载体的BL21做个阴性呢？那样的话，就算存在乳糖的问题，或者象你分析的那样，葡萄糖关闭了乳糖操纵子，使得不需要IPTG诱导就可以表达出目的蛋白。我觉得你的设计虽然巧妙，但好象有点画蛇添足之感。

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非常感谢您参与讨论。谢谢批评。有不同的声音才有进步

第一个问题在前面已经检讨过了

无他，我舍不得做一个空的和转载体的而已。但最开始做转化的时候的确没有想到做个空载体和不含载体的对照，心想未诱导的阴性对照就OK了。其实这也是广泛接受的方法吧。如果结果可疑的话再做完善一些的对照去说明问题。做了这个试验以后发现结果可疑，但又不想等空载体转化的时间，所以就想到用glucose去做个对照。而且我认为这个对照还是有一定说服力的。当然如果最开始空载体的事情就不用这么费劲了。所以这个试验完全不是最开始“有意“的设计。但是换种思路也许能看到不同的方面，对吧？

要说明一下，整个试验并不是为了这个帖子有说服力，目的也不是为了要证明培养基里面有乳糖；这只是我做表达中的一点体会，如此而已。并不是先想到发帖子再做试验，而是拿到结果后一点体会贴出来，呵呵。得到蛋白之后有很多更有意义的事情，很多难题摆在我面前。这些结果只是供我分析用的。结果就是这样，不是为了发paper，估计不会补试验了，如果其它战友有兴趣，可以验证一下。

另外，你提的第一个问题相当好，我从来就没注意过这个问题，我一直都是下午大约4点半左右接种，第二天早晨9点左右再扩大诱导的，我想如果真的存在你所说的那种情况，对我来说是个很好的改进的地方。
不过，我在做TA克隆的时候，也是这么做的，从来没遇到过什么质粒丢失的问题，（测序都已经证明我的结果），要么就是克隆菌和表达菌有差异。所以我还是有点怀疑你这个说法。你能拿出更有力的事实来证明你的结论（没有表达是因为摇菌时间太长质粒丢失而诱导了没有质粒的菌）吗？

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需要指出的是，我并没有下结论。只是在分析可能的原因。

引自第一贴：
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。

要证明这一点，可以设置不同的摇菌时间，不同的转接比例来进行试验。
不知道您的TA克隆是怎么回事。即使培养液中只有10 ％的带质粒的菌，还是可以提到质粒进行测序的。而且我想你用来提质粒的菌是不转接的。

要说明的是，”在使用Amp抗性的时候要注意这一点“，是因为这样做导致没抗性的菌比例会增加，而且可能导致培养基中仅有极少量的带质粒的菌，从而导致失败。但不是100 ％会失败。我还见过提质粒时培养基中不加抗生素的，照样提出来了。当我感到惊讶的时候，他说，我经常这样做啊。。。

另外问个弱点的问题，你用构建好的载体质粒去转化BL21,PCR筛出阳性后，再要筛一遍，看哪些有表达哪些没表达，（有些克隆虽然质粒已经转进去但仍然没有表达，克隆之间有差异，好象是有这么个说法），你这一步做了几个克隆？“表达阳性”率高么？

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就我做的而言，都有表达。我前后挑过8个。其实挑不同克隆做，也是in case而已（我认为）。

还有，你是怎么判断你的蛋白是毒性蛋白的？是已知蛋白么？

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您可能没有仔细看前面的帖子。该目的蛋白对E. Coli没有毒性。

至于如何判断，很多帖子，偶就不添足了

再次谢谢您的思考和讨论！