蛋白质与蛋白组学

谢谢楼主，我最近在诱导一个45kDa的蛋白，一直电泳不成功，拖带，成片，我用的稳流15mA，3.5h。感觉刚接触蛋白就这么麻烦，怎么继续下去做单抗呢？希望指点一下哦~~~还有每个加样孔加的蛋白样品量不一样，会产生影响吗？

==============================================================================================================

您能把图片贴上来，把protocol描述一下吗？样品里面除了SDS还有没有别的detergent？相信如果把详细信息贴上来后会有人提供有价值的建议的

现在我在做内皮抑素基因的表达，我用的菌株是BL21(DE3),质粒是pET-28a(+)，酶切成功，测序也没有问题，我也查了很多文献，质粒和菌株都应该没有问题，而且别人的表达量都很高。我只是想纯化出来和我们实验室的其他药物做个对照。可现在很郁闷。我尝试过不同的温度25.28.30.37，不同的IPTG浓度，但就是没有表达，我也过了一次ni柱，但没有我想要的目的条带。老板建议我在T7启动子的基础上再加一个sp6启动子，我也不知道是否有用，希望搂主在百忙之中给与指点。

======================================================

建议仔细检查：
1 虽然您说测序没问题，不知道您仔细看了是否有移框？
2 有没有rare codon？您是完全follow文献上的protocol（菌株）吗？
3 有没有试过高OD，短诱导的条件？

仅供参考，其它高手继续

我想问的是lactose 真的就可以诱导表达吗?好象真正的诱导物是allolactose吧
IPTG是allolactose而非lactose的类似物,但只有lac operon wild type 才可以将
lactose转变为allolatose 从而实现诱导表达,而很多表达strain 尤其是克隆strain 中的lac operon 被破坏掉了,所以应该不会有本底水平的表达.不然别人工业生产怎么不用Lactose 而用IPTG啊,IPTG 比起来贵多了.

==============================================================================================================

为什么用IPTG而不用lactose？因为后者发生诱导效应的同时也被细菌代谢。因此培养基中的lactose会持续下降。但IPTG就不同了，它既能诱导又不能被降解，所以能保持恒定的浓度。这也是为什么我们叫它做“安慰性诱导物”。

我在做有关单链抗体的表达，我的构建的载体是pCANTAB 5E，原核表达 ;想请教搂住几个问题。
1.原核表达需要大量筛选不同的克隆么？做了菌落PCR鉴定有很亮的阳性带是否就能判断为重组子。
2.诱导表达的时间是否为影响蛋白表达部位的因素呐？有文献说过夜培养目的蛋白就渗漏到上清中，短期培养就在周质腔，这种说法可靠么？我试过表达过夜，但是在上清中检测不到目的蛋白。
3.表达目的蛋白除了过柱，还有别的好的纯化方法么？

谢谢楼主！