蛋白质与蛋白组学

我在做有关单链抗体的表达，我的构建的载体是pCANTAB 5E，原核表达 ;想请教搂住几个问题。
1.原核表达需要大量筛选不同的克隆么？做了菌落PCR鉴定有很亮的阳性带是否就能判断为重组子。
2.诱导表达的时间是否为影响蛋白表达部位的因素呐？有文献说过夜培养目的蛋白就渗漏到上清中，短期培养就在周质腔，这种说法可靠么？我试过表达过夜，但是在上清中检测不到目的蛋白。
3.表达目的蛋白除了过柱，还有别的好的纯化方法么？

谢谢楼主！

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就我所知道的发表一下看法，供您参考：
1. 为了优化表达，有用不同单克隆进行表达，筛选最强者进行表达的；菌落PCR阳性判断重组子，是构建时候的事情。当然还要进行测序。转到表达菌株后，再进行菌落PCR，只是确认一下。
2. 文献说过夜培养目的蛋白渗透到上清？我认为只是针对该文献中的蛋白，或者某些蛋白而言的。不同蛋白特性不一样，表达部位也不一样。比如膜蛋白就可能跟Membrane结合在一起；要验证还是要靠实验。如果你表达过夜没有在上清里面，那说明你这个蛋白就是这样。
3. 据我所知就是过柱，分级沉淀，密度剃度离心了。过柱应该是最好的了

版主，浓缩管是什么呢？

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浓缩管，就是一种膜，能透过小于某特定分子量的分子。在离心的作用下，buffer逐渐排出，蛋白即得以浓缩。

google一下centricon，microcon的image就可以看到实物图片。

谢谢你的回复版主：）
因为很多人都用菌体点样作为跟破碎后、洗涤后、复性纯化后的对比，我也想做的。
至于复性峰的面积就很大，这样回收的液体就很多了，相对蛋白被稀释的倍数就太多了，我用的是普通的s200凝胶柱（检测出来有可能买专门的亲和柱），杂峰有多，我用过冻干法浓缩，蛋白又变性了成沉淀状。SDS电泳做过银离子染色，带太浅，看不清。有办法在蛋白浓度低的情况下检测出哪个才是目的峰么？

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还是不太明白您的问题，
样品直接过分子筛杂峰肯定多吧，我想。可否先跑离子交换？
峰太大？是不是取的peak收集？不用把整个峰收集到一块然后一起跑吧？如果想鉴定某个峰是不是您的蛋白，取peak的中间部分就好了。
在蛋白浓度低的情况，我想如果是生物活性法配合高灵敏度的仪器检测应该还是有可能的（但前提是这个生物活性本身很灵敏，比如产生荧光物质等）。
另外跑分子筛的话上样体积要小哈